Detección molecular de Thecaphora frezii Carranza & Lindquist en semillas de maní (Arachis hypogaea L.)

Abstract

Thecaphora frezii es el agente causal del carbón del maní, enfermedad de gran importancia en la zona productora Argentina. La forma más eficiente de dispersión del patógeno es a través de la semilla, contaminándola superficialmente o en pequeñas lesiones que no son detectadas en los controles de calidad. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un método de detección para Thecaphora frezii en semillas de maní mediante la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Para esto se amplificó y secuenció la región ITS de cuatro aislamientos de T. frezii empleando cebadores universales (ITS1/ITS4). A partir de las secuencias obtenidas, y con el uso del software SeqMan (Lasergene software, DNASTAR ver. 8.0.2, 2008) se obtuvo una secuencia consenso, con la cual se diseñaron los cebadores específicos para T. frezii, TF-2F/TF-2R. Para esto se utilizó el software Primer3 versión 0.5. Con los cebadores obtenidos se realizaron pruebas de especificidad y sensibilidad. Para la primera se realizó una PCR usando ADN de aislados de T. frezii y de otros patógenos transmitidos por la semilla (Sclerotium rolfsii, Sclerotinia minor y Sclerotinia sclerotiorum). Para los aislados de T. frezii se obtuvo una banda de 160 pb, mientras que para los otros patógenos no hubo amplificación. Para la prueba de sensibilidad se inocularon grupos de semillas con suspensiones de teliosporas de diferente concentración: 1x104, 1x103, 1x102, 10 y 1 teliosporas/ml. Se realizó una extracción de ADN y se corrió una PCR. Se observaron resultados positivos hasta 10 teliosporas /ml, siendo este último el límite de detección de la técnica. Debido a que Argentina es el único país donde se encuentra reportada la enfermedad en lotes comerciales, la disponibilidad de un método preciso y sensible de detección de Thecaphora frezii, resulta una herramienta útil para verificar la sanidad de las partidas de exportación, si así lo requiriesen los países compradores. Además, resulta fundamental para estudios epidemiológicos de la enfermedad.

Thecaphora frezii is the causal agent of peanut smut, a very important disease in the Argentine production area. The pathogen can be dispersed by seeds, through surface contamination or small lesions that are not detected in controls. The aim of this work was development a method to detect Thecaphora frezii in peanut seeds using the Polymerase Chain Reaction (PCR) technique. The Internal Transcribed Spacer (ITS) region of four T. frezii isolates was amplified and sequenced using universal primers (ITS1/ITS4). From these sequences, and using software SeqMan (Lasergene software, DNASTAR ver. 8.0.2, 2008) a consensus sequence was obtained. Using the software Primer3 versión 0.5 (Koressaar y Remm, 2007) a pair of primers specific for the pathogen, named TF-2F and TF-2R, was synthesized. The primers were analyzed for specificity and sensitivity tests. The first test involved a PCR using DNA from T. frezii and other seed-transmitted pathogens (Sclerotium rolfsii, Sclerotinia minor and Sclerotinia sclerotiorum). A 160-pb fragment was obtained for the T. frezii isolates, whereas no amplification was observed for the remaining pathogens. For the sensitivity test, groups of seeds were inoculated whit teliospore suspensions at different concentrations: 1x10 4 , 1x10 3 , 1x10 2 , 10 and 1 teliospores/ml. A DNA extraction was performed a PCR was run. Positive results were observed at concentrations up to 10 teliospores /ml, the latter being the PCR detection limit. Because Argentina is the only country where the disease is reported, the availability of the detection method of Thecaphora frezii by PCR technique is usefu to check the health of peanut exportation. The specificity of this method, along with its sensitivity, makes it an important tool for epidemiological studies of peanut smut.