Evaluación del tratamiento combinado de Alendronato y Monofluorofosfato de sodio en la remodelación ósea en ratas

Abstract

Estudios previos han demostrado que los bisfosfonatos, como Alendronato de sodio (AL), son potentes inhibidores de la resorción ósea y aumentan la densidad mineral del hueso. El fluoruro administrado como Monofluorfosfato de Sodio (MFP) estimula la formación e incrementa el volumen del hueso, efecto específicamente debido a la estimulación de la actividad osteoblástica. Objetivo: Evaluar el efecto del tratamiento combinado de AL vía subcutánea y de MFP vía oral sobre la regeneración tisular de cavidades óseas neoformadas en tibias de ratas. Materiales y métodos: Las fórmulas farmacéuticas se prepararon con una dosificación de 0,5 mg/kg de peso para AL y de 5 mM para MFP. El ensayo de citotoxicidad se realizó por medio del Método de captación de rojo neutro. Este colorante penetra en las membranas celulares y se fija a la matriz lisosomal. Es posible así distinguir entre células viables, dañadas o muertas de acuerdo a la acumulación del rojo neutro dentro del lisosoma. Para este ensayo se utilizó la línea celular VERO cuyas células fueron cultivadas en un Medio Esencial Mínimo (MEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino a una densidad celular de 70% a 80% de confluencia. La viabilidad celular se estimó a través de la extracción del colorante presente en vacuolas celulares. Para analizar la toxicidad de MFP se realizaron ensayos “in vivo”. Se midió peso corporal, glucosa sanguínea y relación ceniza/matriz. Se emplearon sesenta y cuatro ratas macho de la línea Wistar de peso 160 ± 20 g, y se dividieron en 4 grupos de 16 ratas cada uno. El grupo C recibió semanalmente 0,3 ml/100g de peso corporal de solución salina vía subcutánea cercana a la intervención quirúrgica y actuó como grupo control. El grupo A recibió semanalmente 0,5 mg de AL/Kg de peso corporal por vía subcutánea profunda en el miembro posterior izquierdo. El grupo M fue tratado con MFP en el agua de bebida durante el tiempo que duró el experimento y en las áreas de la cirugía los animales recibieron una inyección subcutánea de solución salina como el grupo control. El grupo AM recibió tratamiento combinado con AL subcutáneo y MFP por vía oral en el agua de bebida. Estos animales tuvieron acceso a agua corriente de red “adlibitum”. El tiempo total de la experiencia fue de 90 días. En la cirugía se realizó una incisión longitudinal en ambas tibias y a través del decolado se llegó a exponer el hueso, realizando un defecto circular en la parte plana de cada tibia hasta llegar al hueso medular. Dicho defecto no fue rellenado con ningún material. Se tomaron radiografías de cada tibia a 0, 15, 30, 60 y 90 días y fueron analizadas con el Software Image Pro Plus versión 4.1 de Media Cibernetics. También se evaluó fosfatasa alcalina (FA) en sangre mediante métodos colorimétricos en los mismos tiempos. Los animales fueron sacrificados a los 15, 30, 60 y 90 días. Se recolectaron ambas tibias y además los fémures para ser utilizados en ensayos biomecánicos. Se realizaron estudios histopatológicos previa descalcificación de las tibias con EDTA y su inclusión en parafina. Los cortes fueron teñidos con HE y observados con microscopía óptica (MO). Los estudios estadísticos se realizaron a través del análisis de la variancia a dos y tres criterios declasificación (tratamientos, tiempo, tibia problema/tibia contralateral). El nivel de significación fue p<0.01. Resultados: Se observó que a concentraciones menores a 10 μg/ml de AL la viabilidad celular fue cercana al 100 %. A medida que aumentaron las concentraciones por encima de los 10 μg/ml la viabilidad celular comenzó a verseafectada, aunque nunca por debajo del 70%. No se hallaron diferencias significativas entre el grupo tratado con MFP y el grupo control en las variables de toxicidad “in vivo” analizadas. Los estudios radiográficos demostraron que AL desde el día 0 comenzó a aumentar la densidad óptica (OD), siendo el valor más alto a los 60 días, declinando hacia el día 90, donde los valores se estabilizaron. MFP se comportó de manera similar a AL, aunque la OD promedio fue menor. El tratamiento combinado incrementó la OD pero con valores menores al de las drogas por separado. No hubo diferencias significativas entre tibia problema y contralateral. Los estudios de fosfatasa alcalina (FA) revelaronun aumento gradual de este marcador en los grupos problemas con respecto al control. El análisis histológico demostró que AL y MFP presentaron mayor actividad osteogénica observándose trabéculas más gruesas y anastomosadas, con mayor relevancia en el tiempo 60 y estabilizándose al tiempo 90. La histomorfometría reveló un aumento del porcentaje de hueso trabecular a través del tiempo para AL y MFP siendo el más evidente el tiempo 60. El tratamiento combinado no fue estadísticamente diferente al grupo control. Los ensayos biomecánicos demostraron para AL y MFP un aumento en la rigidez a los 60 días. El tratamiento combinado no mostró diferencias significativas para dicho parámetro. En cuanto a la fuerza de fractura y la energía absorbida, no hubo diferencias entre los grupos. Conclusiones: AL vía subcutánea a bajas dosis no es citotóxico y MFP por vía oral a dosis de 5 mM no afecta la viabilidad celular. El aumento de FA se corresponde con un aumento de la actividad osteoblástica. AL y MFP aumentaron la OD significativamente como así también el número y grosor de las trabéculas analizadas al MO. La rigidez fue aumentada por AL y MFP. El tratamiento combinado de AL y MFP no demostró sinergismo en los tiempos de la experiencia probablemente debido a un efecto antagónico. Palabras clave: Bisfosfonatos, alendronato, MFP, fluoruro, actividad osteoblástica.