Estudio de la expresión y características biológicas de fenotipos inducidos in vitro de neutrófilos humanos.

Abstract

Los polimorfonucleares neutrófilos (PMN) desempeñan un rol clave en la inmunidad innata frente a infecciones especialmente bacterianas y fúngicas, pero en la actualidad estos leucocitos por su potencial versatilidad en cuanto a sus funciones, han sido propuestos como células moduladoras de la inmunidad adaptativa. Se han descripto algunos PMN neutrófilos en sitios de inflamación que expresan fenotipo de célula presentadora de antígenos (CPA) —se consideran a las moléculas B7 (B7-1, CD80 y B7-2, CD86) y a CMH clase II (HLA-DR) como marcadoras del fenotipo CPA de PMN neutrófilo— y este aspecto constituye un área de interés científico y ha motivado este trabajo de investigación científica. El objetivo de esta Tesis es el estudio de la expresión y características biológicas de fenotipos inducidos in vitro de PMN neutrófilos humanos. Materiales y métodos: En las muestras se realizaron ensayos con estimuladores clásicos y con uno no clásico para generar los fenotipos. La expresión de moléculas de los diferentes fenotipos y la liberación de trampas extracelulares neutrófilas (NETs) se evidenciaron mediante inmunofluorescencia. Las observaciones de interacciones celulares de contacto se realizaron mediante microscopía óptica y electrónica. Los fenotipos inducidos in vitro con estimuladores surgen de la comparación con el “fenotipo PMN neutrófilo control” de las muestras apareadas sin estimulación. Para el desarrollo del trabajo se utilizaron muestras donadas por el Banco de Sangre del Instituto de Hematología de la UNC, en anonimato, con consentimiento informado y aprobación del proyecto por el Comité de Ética del Hospital Nacional de Clínicas, FCM, UNC, registro 169/13. Resultados: se observaron las siguientes características del fenotipo inducido in vitro de “PMN neutrófilo-CPA”. a) expresa en superficie las moléculas HLA-DR (CMH) y moléculas coestimuladoras B7 (CD80 y CD86); b) presenta una vida media en cultivo que varía según los activadores (con LPS: 48 hs, con OVA: 60 hs); c) es capaz de generar NETs con activadores clásicos (LPSy fMLP) y no clásico (OVA); d) las NETs pueden contener moléculas coestimuladoras B7 (CD80 y CD86); e) las NETs que contienen moléculas coestimuladoras promueven aumento de sinapsis inmunes. Por otro lado, se evidenciaron las siguientes características del fenotipo inducido in vitro de “PMN neutrófilo CD4-CD45RO”: a) expresa en superficie las moléculas CD4 y CD45RO; b) presenta una vida media en cultivo de 30 minutos con los activadores LPS, fMLP y OVA; c) es capaz de generar NETs con activadores clásicos y uno no clásico; d) las NETs pueden contener moléculas CD4 y CD45RO. Conclusiones: Se considera que el desarrollo de este trabajo científico aporta nuevos datos sobre las importantes funciones inmunológicas que llevan a cabo las células implicadas. Los hallazgos con respecto a la expresión de moléculas características de las CPAs profesionales en PMN neutrófilos, permiten definirlos como potenciales CPAs. En este estudio sobre la expresión y características biológicas de fenotipos de PMN neutrófilos inducidos in vitro se halló la expresión de moléculas coestimuladoras B7 y del CMH II: HLA-DR en las NETs lo que otorga una nueva perspectiva a las trampas extracelulares influenciando en el entorno celular y adquiere gran importancia por la posibilidad de ruptura de la autotolerancia, tal como sucede en enfermedades autoinmunes. Estos resultados pueden ser tenidos en cuenta como posibles blancos terapéuticos. Además, por otra parte, el hallazgo de la expresión de moléculas no convencionales del fenotipo PMN neutrófilo-CD4, CD45RO y la liberación de NETs conteniendo dichas moléculas pueden sentar las bases de futuras investigaciones donde se evalúe su significado funcional. Esto tiene interés por ejemplo en el estudio de la infección por HIV ya que podría influir en la biodistribución del mismo, siendo CD4 el receptor primario de este virus. La posibilidad de los PMN neutrófilos que en determinadas condiciones desempeñen roles de CPA comprometiendo la vía de coestimulación B7-1 (CD80) / B7-2 (CD86): CD28 – CTLA 4 en las diferentes subpoblaciones de células T tendría importancia en la inmunoregulación y la patogénesis de diversas enfermedades donde las NETs también pueden estar implicadas.

Polymorphonuclear neutrophils (PMN) play a key role in innate immunity especially against bacterial and fungal infections, but at present these leukocytes, because of their potential versatility in their functions, have been proposed as modulators of adaptive immunity. Some PMN neutrophils have been described at sites of inflammation that express antigen-presenting cell (APC) phenotype —B7 molecules (B7-1, CD80 and B7-2, CD86) and MHC class II (HLA-DR) are considered as markers of the PMN neutrophil APC phenotype— and this aspect constitutes an area of scientific interest and has motivated this scientific research work. The objective of this thesis is the study of the expression and biological characteristics of phenotypes induced in vitro of human PMN neutrophils. Material and methods: In the samples, tests were performed with classic stimulators and with one non-classical stimulator to generate the phenotypes. The expression of molecules of the different phenotypes and the release of extracellular neutrophil traps (NETs) were evidenced by immunofluorescence. The observations of cellular contact interactions were made by optical and electronic microscopy. The phenotypes induced in vitro with stimulators arise from the comparison with the "control PMN neutrophil phenotype" of paired samples without stimulation. To the development of this investigation the samples were donated by the Blood Bank of the Hematology Institute of the UNC, in anonymity, with serology data, with informed consent with approval by the Ethics Committee of the Hospital Nacional de Clínicas, FCM, UNC, record 169/13. Results: the following characteristics of the in vitro induced phenotype of "PMN neutrophil-APC" were observed. a) They expresses on the surface the HLA-DR molecules (MHC) and costimulatory B7 molecules (CD80 and CD86); b) They have a half-life in culture that varies according to the activators (with LPS: 48 hours, with OVA: 60 hours); c) They are capable of generate NETs with classic (LPSy fMLP) and non-classical (OVA) activators; d) NETs may contain costimulatory B7 molecules (CD80 and CD86); e) NETs that contain costimulatory molecules promote an increase in immune synapses. On the other hand, the following characteristics of the in vitro induced phenotype of “PMN neutrophil CD4-CD45RO" were evidenced: a) They expresses on the surface the CD4 and CD45RO molecules; b) They have a half-life in culture of 30 minutes with LPS, fMLP and OVA activators; c) They are capable of generate NETs with classical activators and one non-classical activator; d) NETs may contain CD4 and CD45RO molecules. Conclusions: It is considered that the development of this scientific work provides new data on the important immunological functions carried out by the involved cells. The findings regarding the expression of characteristic molecules of professional APCs in PMN neutrophils allow us to define them as potential APCs. In this study on the expression and biological characteristics of PMN neutrophil phenotypes induced in vitro, we found the expression of costimulatory molecules B7 and CMH II: HLA-DR in NETs which gives a new perspective to extracellular traps influencing the cellular environment and it acquires great importance because of the possibility of rupture of self-tolerance, as it happens in autoimmune diseases. These results can be taken into account as possible therapeutic targets. In addition, on the other hand, the finding of the expression of non-conventional molecules of PMN neutrophil-CD4, CD45RO phenotype, and the release of NETs containing these molecules can lay the foundations for future investigations where their functional significance is evaluated. This is of interest, for example, in the study of HIV infection since it could influence its biodistribution, with CD4 being the primary receptor for this virus. The possibility of PMN neutrophils that under certain conditions play roles of APC compromising the costimulation pathway B7-1 (CD80) / B7-2 (CD86): CD28-CTLA 4 in the different subpopulations of T cells would be important in immunoregulation and the pathogenesis of various diseases where NETs may also be involved.