Participación de la autofagia en la fisiopatología y progresión de la leucemia linfática crónica

Abstract

El objetivo general de este trabajo fue estudiar la participación de la autofagia en la fisiopatogenia y progresión de la Leucemia Linfática Crónica (LLC). Con el fin de evaluar la respuesta de los Linfocitos B (LiB) neoplásicos frente a agentes inductores de autofagia, analizamos en primer lugar la respuesta autofágica celular frente al uso de inhibidores del complejo diana de Rapamicina (Rapa) en células de mamíferos (mTOR). Luego evaluamos si inhibidores de mTOR como Rapa modulan la muerte celular de los LiB inducida por Fludarabina (Fd). Tambien estudiamos la influencia del microambiente tumoral sobre la actividad autofágica de los LiB en pacientes con enfermedad estable y progresiva. Para realizar este trabajo, se llevó a cabo la recolección de las muestras y recopilación de datos de pacientes evaluados al diagnóstico y durante el curso de la enfermedad, atendidos en el Instituto Oncológico Universitario del Hospital Nacional de Clínicas, teniendo en cuenta los criterios de selección preestablecidos. El proyecto contó con la aprobación del Comité de Ética y del Registro Provincial de Investigación en Salud de Córdoba. Los test estadísticos utilizados para comparación de grupos de datos y curvas de sobrevida se realizaron con el software Graph Pad Prism 7.0. Los resultados presentados demuestran que la inhibición de mTOR con Rapa induce aumento de la cadena liviana 3 de la proteína asociada a microtúbulos (LC3-II), como reflejo de la actividad autofágica celular en los LiB neoplásicos de la LLC y que dicha actividad es muy heterogénea entre los pacientes estudiados. También demostramos que Rapa incrementa la muerte celular inducida por Fd en LiB de LLC y que la respuesta al tratamiento combinado (Rapa+Fd) se correlacionó con los niveles basales de la proteína anti-apoptótica BCL-2 (proteína 2 del linfoma de células B) y factores de mal pronóstico como la expresión de ZAP-70 (proteína asociada a la cadena zeta) y CD38. Así, pacientes con bajo índice de BCL-2 presentaron mayor respuesta al tratamiento combinado con respecto a aquellos con índice alto. También observamos que niveles altos de autofagia basal correlacionaron con estadios clínicos avanzados, genes de la región variable de la cadena pesada de las inmunoglobulinas (IGVH) no mutados, y menor sobrevida libre de progresión (SLP). Finalmente, para analizar la influencia del microambiente tumoral en la actividad autofágica, realizamos la diferenciación “in vitro” de células nodrizas, “Nurse like cells” (NLC), a partir del cultivo de células mononucleares totales (CMT) obtenidas de sangre periférica (SP) de pacientes, durante 14 dias. Luego evaluamos su efecto por contacto directo con los LiB tanto en co-cultivos, como a través de las quimiocinas que ellas secretan (CXCL12). Encontramos que el contacto de los LiB con las NLC, genera aumento de LC3-II, de la proteína anti-apoptótica BCL-2 y de CD38. El mismo efecto se observa en la fracción proliferativa CXCR4dimCD5high del clon circulante, es decir la fracción del clon que contactó con células del microambiente. Como conclusión, nuestros resultados demuestran que los LiB de la LLC responden a inhibidores de mTOR aumentando la actividad autofágica. Además, Rapa ejerce un efecto sinérgico aumentando la muerte celular cuando las células son tratadas con Fd, un análogo de las purinas, utilizado como tratamiento de primera línea en LLC. Este efecto interesantemente se correlaciona con los niveles basales de BCL-2 y factores de mal pronóstico como la expresión de ZAP-70 y CD38. Teniendo en cuenta los nuevos paradigmas de tratamiento basados en la inhibición de BCL-2, consideramos que evaluar el índice de BCL-2 por técnicas de alta sensibilidad como la citometría de flujo podría ser relevante como marcador predictivo de respuesta al tratamiento. Por otro lado, el uso de inhibidores de mTOR como Rapa, a dosis bajas y asociado a otras drogas inductoras de apoptosis podría aumentar la muerte celular en LLC, mejorando por lo tanto la eficacia del tratamiento. Finalmente, el aumento de la autofagia basal en estadios avanzados de la enfermedad, su correlación con menor SLP sumado al efecto de las células del microambiente en la expresión de LC3-II y BCL-2, sugiere que la autofagia tiene un importante rol en la progresión de la enfermedad y que además interviene promoviendo la sobrevida del clon leucémico cuando éste contacta con células del estroma en los nichos de proliferación.

The general objective of this work was to study the participation of autophagy in the physiopathogenesis and progression of Lymphocytic Chronic Leukemia (CLL). In order to evaluate the response of neoplastic B lymphocytes to autophagy-inducing agents we first analyzed the cellular autophagic response to the use of mammalian target of Rapamycin (Rapa) (mTOR) inhibitors. Afterwards, we evaluated whether mTOR inhibitors such as Rapa, modulate Fludarabine (Fd) induced B cells death. We also studied the influence of the tumor microenvironment on the autophagic activity of B lymphocytes in patients with stable and progressive disease. To carry out this work, samples and data were collected from patients evaluated at diagnosis and also during the course of the disease treated at the Instituto Oncológico Universitario of Hospital Nacional de Clinicas, following the selection criteria for inclusion or exclusion. The project had the approval of the Ethics Committee and the Provincial Registry of Health Research of Cordoba. The statistical tests used to compare data groups and survival curves were performed with the Graph Pad Prism 7.0 software. The results presented show that the inhibition of mTOR with Rapa induces an increase in the microtubule- associated protein chain 3 (LC3-II), as a consequence of the cellular autophagic activity in the neoplastic B cells of CLL; also that the activity is very heterogeneous among the patients studied. We also demonstrated that Rapa increases Fd induced cell death in CLL B cells and the response to combined treatment (Rapa+Fd) was correlated with the basal anti-apoptotic protein BCL-2 (B-cell lymphoma-2) levels and poor prognostic factors such as ZAP-70 (z-chain-associated protein) and CD38 expression. Thus, patients with a low BCL-2 index showed a greater response to combined treatment compared to those with a high index. We also observed that high levels of basal autophagy correlated with advanced clinical stages, non-mutated immunoglobulin heavy-chain variable (IGHV) genes, and lower progression- free survival (PFS). Finally, to analyze the influence of the tumor microenvironment on autophagic activity, we performed the differentiation of nurse like cells (NLC), from the culture of total mononuclear cells (TMC) of patients, for 14 days. Then we evaluated its effect by direct contact withB cells both in co- cultures, and through the chemokines that they secrete (CXCL12). We found that the contact of B lymphocytes with NLC in co-cultures generates an increase in LC3-II, the anti-apoptotic protein BCL-2 and CD38. The same effect is observed in the CXCR4dimCD5high proliferative fraction of the circulating clone, that is, the one that contacted with the microenvironment. In conclusion, our results demonstrate that CLL B cells respond to mTOR inhibitors by increasing autophagic activity. Furthermore, Rapa exerts a synergistic effect increasing cell death when cells are treated with Fd, a purine analog, used as a first-line treatment in CLL. This effect interestingly correlates with basal BCL-2 levels and poor prognostic factors such as the expression of ZAP-70 and CD38. Taking into account the new treatment paradigms based on the inhibition of BCL-2, we consider that evaluating the BCL-2 index by highly sensitive techniques such as flow cytometry could be relevant as a predictive marker of response to treatment. On the other hand, theuse of mTOR inhibitors such as Rapa, at low doses and associated with other apoptosis-inducing drugscould increase cell death in CLL, thus improving the efficacy of treatment. Finally, the increase in basal autophagy in advanced stages of the disease, its correlation with lower PFS and OS added to the effect of microenvironmental cells on the LC3-II and BCL-2 expression, suggests that the autophagy plays an important role in the progression of the the disease and also promotes the survival of the leukemic clone when it contacts stromal cells in the proliferation niches.