Aplicabilidad de microfluorescencia de rayos X en muestras biológicas incluidas en parafina: análisis de los efectos de ácidos grasos poliinsaturados sobre un modelo animal de cáncer mamario

Abstract

El cáncer es una enfermedad que se caracteriza por un crecimiento descontrolado de células que provoca millones de muertes en el mundo. Uno de los más comunes es el cáncer de mama cuyo diagnóstico temprano permite mayores posibilidades de curación. Las causas de esta enfermedad pueden ser diversas y una de ellas es la alimentación. Existe una gran variedad de alimentos que tienen comprobada acción tumoral dentro de los que se encuentran los ácidos grasos. Los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) pertenecen a los ácidos grasos esenciales, cuyo metabolismo con enzimas y productos finales tienen efectos diferentes sobre la célula tumoral. En este trabajo se analizó la fisiopatología del cáncer de mama en un modelo animal que tuvo exposición a una fuente de alto contenido de omega 3 u omega 6 utilizando la técnica micro-XRF. Para ésto, se evaluó la aplicabilidad de la micro-XRF sobre cortes delgados de tejidos incluidos en parafina. Esta técnica provee información acerca de la identificación, cuantificación y localización de elementos químicos como el calcio, zinc, cobre, hierro y fósforo. Los resultados obtenidos con esta técnica sobre las distribuciones espaciales elementales se compararon con las imágenes obtenidas a partir de la técnica histológica convencional. Se utilizaron 40 ratones albinos BALB/C que fueron distribuidos en tres grupos dietarios durante el periodo de 3 meses: al primero se le administró aceite de chía como fuente de ω-3, al segundo se le suministró aceite de Cártamo como fuente de ω-6 y el tercero corresponde al grupo control sin agregados lipídicos. Todos los grupos fueron inoculados con células de adenocarcinoma de glándula mamaria trasplantable murina con capacidad metastásica moderada por vía subcutánea. Luego los animales fueron sacrificados a los 45-50 días y se extrajo el tumor para su inclusión en parafina y análisis. A cada una de las muestras se le realizó dos cortes adyacentes: uno de 6-7 μm para el análisis histológico en el Laboratorio de Microscopía de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Nacional de Córdoba y el segundo de 30 μm para analizarlo a través de micro-XRF en Brazilian Syncrotron Light Laboratory (LNLS) en Campinas, Brasil. Para el ánalisis de imágenes se emplearon los Software ImageJ y Photoshop Cs6. Además, se desarrolló un código en GNU Octave que permitió graficar y seleccionar sólo aquellas áreas de interés. Para realizar un análisis cuantitativo preciso, fue necesario implementar el uso de estándares que fueron fabricados a partir de un estudio exhaustivo de las características de los tacos de parafina para encontrar un material que sea equivalente al tejido biológico.. La colofonia fue la sustancia elegida, ya que cuenta con características frente a los rayos x similares al tejido y es compatible con la parafina. A partir del análisis de imágenes de ambas técnicas, se constató que el P se localiza en áreas de células tumorales viables. De esta manera el fósforo podría ser un biomarcador de viabilidad tumoral. Se observó una disminución de las concentraciones de zinc, en muestras de chía con respecto al control (p <0,05). Con respecto al hierro y cobre, no se manifestaron cambios de importancia, aunque en los controles se observaron señales de Fe más altas con respeto a las muestras con chía, alcanzando valores 2 a 3 veces mayores. Por último, en el Análisis de Componentes Principales, el cobre fue el único que no se comportó como el resto de los elementos en muestras de chía. A partir de este estudio, puede concluirse que es factible la aplicabilidad del análisis de micro-Fluorescencia de Rayos-X como herramienta futura de diagnóstico en muestras incluidas de parafina. El análisis por micro- XRF se configura como una fisiopatología de múltiples enfermedades.

Cancer is a disease characterized by an uncontrolled growth of cells that causes millions of deaths worldwide. One of the most common is breast cancer whose early diagnosis allows a greater chance of cure. The causes of this disease can be diverse and one of them is food. There is a wide variety of foods that have proven tumor action, including fatty acids. Polyunsaturated fatty acids (PUFAs) belong to essential fatty acids, whose metabolism with enzymes and end products have different effects on the tumor cell. In this work, the pathophysiology of breast cancer from an animal model that had exposure to an omega 3 source was analyzed by micro-XRF technique. This technique provides information about the identification, quantification and location of chemical elements such as calcium, zinc, copper, iron and phosphorous. The results obtained with this technique on the elementary spatial distributions were compared with the images obtained from the conventional histological technique. On the other hand, the applicability of the micro-XRF on thin sections of tissues embedded in paraffin was evaluated. Forty albino BALB / C mice were used, which were distributed in three dietary groups during the 3- month period: the first was given chia oil as a source of ω-3, the second was given safflower oil as a source of ω- 6 and the third corresponds to the control group without lipid aggregates. All groups were inoculated with murine transplantable mammary gland adenocarcinoma cells with moderate metastatic capacity subcutaneously. The animals were then sacrificed at 45-50 days and the tumor was removed for analysis. Two adjacent sections were made to each of the samples: one of 6-7 μm for histological analysis in the Microscopy Laboratory of the Faculty of Agricultural Sciences of the National University of Córdoba and the second of 30 μm to analyze it by micro-XRF in Brazilian Syncrotron Light Laboratory (LNLS) in Campinas, Brazil. For the analysis of images the ImageJ and Photoshop Cs6 Software were used. In addition, a code was developed in GNU Octave that allowed to graph and select only those areas of interest. To carry out an accurate quantitative analysis, it was necessary to implement the use of standards that were manufactured from an exhaustive study of the characteristics of paraffin blocks to find a material that is equivalent to biological tissue. Rosin was the chosen substance, since it has characteristics against x-rays similar to tissue and is compatible with paraffin. From the image analysis of both techniques, it was found that P is located in areas of viable tumor cells. In this way, phosphorus could be a biomarker of tumor viability. A decrease in zinc concentrations was observed in chia samples with respect to the control (p <0.05). Regarding iron and copper, there were n15 significant changes, although higher Fe signals were observed in the controls with respect to the samples with chia, reaching values 2 to 3 times higher. Finally, in the Principal Component Analysis, copper was the only one that did not behave like the rest of the elements in chia samples. From this study, it can be concluded that the applicability of the micro-XRF analysis is feasible in included paraffin samples. Micro-XRF analysis is configured as an optimal methodology that does not destroy the samples and that allows retrospective studies to explain the pathophysiology of multiple diseases.