Modificaciones inducidas por Ghrelina exógena sobre la actividad funcional de las gametas, la fertilización y el desarrollo embrionario temprano en un modelo murino.

Abstract

Ghrelina (Ghr) es un polipéptido que vincula el balance energético con la reproducción.Si bien la hiperghrelinemia secundaria a restricción alimentaria reduce el éxito reproductivo, los nive les de Ghr aumentan fisiológicamente durante la gestación, por lo que se ha sugerido que esta proteína cumple un papel importante en este proceso. Los objetivos del presente Trabajo de Tesis fueron: 1) explorar mediante experimentos in vitro, los efectos de Ghr (10-9 y 10-7M) y/o su antagonista ((D-Lys3) GHRP-6, 10-5 y 10-4M) sobre la motilidad, vitalidad y reacción acrosomal espontánea o inducida por progesterona (P4) a los 3, 40 y 120 min de incubación, así como sobre la fertilización in vitro; 2) determinar el papel de Ghr en la fertilización in vivo, inyectando hembras de ratón con Ghr (2 ó 4 nmol/animal/día) y/o el antagonista (6 nmol/animal/día) durante una semana previa a la cópula y hasta la misma, evaluando a los 18 días de gestación el éxito reproductivo; 3) establecer el papel de Ghr en el desarrollo embrionario temprano y la implantación, inyectando a las hembras preñadas con Ghr y/o el antagonis ta, a) desde la inducción de ovulación hasta las 80 h de la misma, evaluando el porcentaje de fertilización y el desarrollo embrionario pre-implantatorio o, b) desde el 3º al 7º día de preñez, sacrificando las hembras a los 18 días poscópula y cuantificando el éxito reproductivo. En base a los resultados se agregó un cuarto objetivo: 4) evaluar, en hembras inyecta das con la mayor dosis de Ghr y/o el antagonista desde el día 3 al 7 de gestación, la anátomo-patología uterina, la marcación inmunohistoquímica de óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) e inducible (iNOS) y la concentración plasmática de P4. Refe rente al objetivo 1, observamos que Ghr disminuyó la motilidad espermática y aumentó la reacción acrosomal a los 3 min de incubación (motilidad: control=54,1±4,3 vs Ghr 10-M=42,7±6,0 y Ghr 10-7M=40,7±5,9. Reacción acrosomal: control=9,6±1,2 vs Ghr 10-9M=13,2±1,2; n=8/grupo, p<0,05). Este efecto no se detectó a los 40 ni a los 120 min. Los tratamientos no modifica ron los índices de fertilización in vitro,ni los de partenogénesis. En cuanto al objetivo 2, Ghr 4 nmol aumentó el porcentaje de hembras con pérdida embrionaria (Ghr 4 nmol=73 vs control= 11, n=11 y 9/grupo respectivamente, p<0,05) y el antagonista aumentó el porcentaje de hembras con atrofia fetal y el porcentaje de fetos atrofiados/hembra. En el objetivo 3a, el antagonista disminuyó la tasa de fertilización y todos los tratamientos retrasaron el desarrollo embrionario (porcentaje de blastocitos: control=78 vs Ghr 4 nmol=51, Ghr 2 nmol=62, hr+antagonista = 48 y antagonista=61, n=79-102 embriones/tratamiento, p<0 ,05). Cuando los tratamientos fueron aplicados durante el período peri-implantatorio (objetivo 3b), tanto Ghr como el antagonista disminuyeron el peso fetal y la ganancia de peso de las hembras gestantes (p<0,05). Asimismo, Ghr 4 nmol, Ghr+antagonista y antagonista aumentaron el porcentaje de hembras con pérdida embrionaria o atrofia fetal. En el cuarto objetivo, se detectó un aumento significativo de las resorciones embrionarias y del porcentaje de atrofia fetal en las hembras tratadas con el antagonista; aparentemente los efectos de Ghr ocurrirían en forma más tardía. Ghrelina y el antagonista aumentaron la expresión de eNOS e iNOS uterina. Como hallazgos preliminares observamos que los tratamientos con Ghr o el antagonista aumentaron la marcación de células “na tural killer” uterinas, macrófagos y linfocitos. En resumen, es aparente que existe un nivel intragestacional “ideal” de Ghr, por encima o debajo del cual se registran alteraciones en la gestación temprana. Algunas evidencias preliminares apuntan al óxido nítrico (NO) y a la respuesta inmunológica materna como posibles causas de estas alteraciones