Estudio de la interacción de péptidos bioactivos con lípidos

Abstract

Establecer una relación molecular racional en la interacción lípido/péptidos bioactivos para entender la formación de amiloides en la interfase agua/aire. Las condiciones estudiadas incluyen estabilidad y miscibilidad lateral de mezclas lípido/péptido, secuencias, conformación y estructura secundaria que los péptidos adquieren en la superficie y su capacidad de formar estructuras amiloideas con lípidos de diferentes estados físicos.

El lípido POPC en estado líquido-expandido y nano-organizado en monocapas lipídicas induce estructuras fibrilares en los péptidos Aβ amiloides en la interfase agua/aire con una proporción baja de péptido. Las imágenes de BAM mostraron claramente estructuras fibrilares 3D que son ThT positivas y fueron bien visualizadas por AFM luego de transferir las nanoestructuras a un soporte de mica. Por el contrario, cuando se utilizó DSPC (estado líquido-condensado) en la mezcla con péptidos Aβ amiloides, el comportamiento lateral fue inmiscible sin formar estructuras fibrilares. Cuando se realizaron mezclas del péptido Aβ amiloide con el lípido DPPC, que sufre transición bidimensional LE→LC la formación de las fibras depende claramente en qué región de fase se encuentra DPPC, siendo favorecida en la fase LE e inhibida en la fase LC. Los péptidos truncados Aβ(1-37/38/39) cuando se mezclaron a baja proporción (95:05) con el lípido POPC no formaron fibras amiloides que pudieran ser claramente apreciables por BAM, lo que indica la influencia crítica de tan solo un solo residuo en proceso de fibrilación. Sin embargo, la reversión de la secuencia de los Aβ(1-40/42) en mezcla a baja proporción (95:05) con POPC estableció una diferencia estructural marcada en las fibras formadas, apreciándose en ambos casos estructuras fibrilares aisladas y oligómeros en comparación con los networks visualizados cuando los péptidos utilizados estaban en su secuencia natural. La fibrilación del péptido amiloide en la interfase agua/aire puede modularse dinámicamente por la calidad del entorno acuoso de la fase lipídica, la proporción de la proteína en la mezcla, el empaquetamiento lateral, así como la reversión de la secuencia de los péptidos amiloides y el número de aminoácidos en el C-terminal del amiloide. La mezcla fisiológica de gangliósidos totales fue capaz de disolver ensamblajes de estructuras fibrilares inducidos por POPC en el péptido Aβ (1–40) en un sistema modelo de membrana (monocapas de Langmuir). El análisis de imágenes BAM mostró ciertamente la disolución de dominios redondeados ThT positivos y estructuras fibrilares distinguiéndose una fase más homogénea en un entorno lipídico sin desorción de proteínas de la interfase. Este proceso puede conceptualizarse como una transición cooperativa de la disposición supramolecular del Aβ amiloide estructurado en forma de fibras, lo que es inducido por cambios en el entorno lipídico desencadenados por los gangliósidos en la interfase. La fibrilación de amiloide inducida por POPC puro puede disolverse dinámicamente cuando los gangliósidos se mezclan lateralmente con las estructuras fibrilares, pero preservando la disposición de la monocapa. Nuestros resultados sugieren que la calidad de la superficie y las propiedades de los componentes lipídicos interfaciales son importantes para que el péptido Aβ adquiera una estructura molecular definida en un entorno de membrana. El péptido Melittin induce auto-estructuración con la formación de dominios redondeados y fibras tipo amiloides cuando se mezcla con el lípido DSPC de características líquidocondensado en la interfase agua/aire, dependiendo de la proporción del área peptídica en la mezcla. Las imágenes de monocapas mezclas tomadas con la técnica BAM mostraron claramente estructuras fibrilares 3D y dominios redondeados en la interfase sin disolverse en la subfase. Estas estructuras identificadas fueron marcadas peculiarmente con ThT destacando por primera vez una disposición lípido/péptido en la interfase con un péptido (melittin) que tiene propiedades antimicrobianas y no ha sido identificado como amiloide. Las estructuras también se visualizaron por AFM y SEM luego de ser transferirlas a un soporte de mica. Dichas estructuras fibrilares en la mezcla DSPC/Melittin (50:50) se caracterizan por cambios en el reordenamiento molecular de péptidos y lípidos según las variaciones de señales vibracionales observadas por ATR-FTIR, así como cambios en las longitudes de onda de emisión usando la sonda ThT en microscopía de fluorescencia. Por lo tanto, podemos decir que la amiloidogénesis no es un proceso restringido a péptidos Aβ amiloides, sino que puede manifestarse en péptidos con propiedades antimicrobianas y tóxicas como melittin, además es modulado por el estado físico de los lípidos. Por el contario este fenómeno de fibrilación no fue observable con el lípido POPC en estado líquido-expandido, lo que indica que el grado de hidratación de los componentes en la interfase es un factor importante para el efecto descrito. Las estructuras fibrilares de la mezcla DSPC/Melittin en su superficie tienen un alto contenido de lípidos DSPC según el análisis de reflectividad a partir de las imágenes de BAM incluso cuando la PAP se aumentó ligeramente al 60%. Dada la peculiar organización y estabilidad de esta mezcla en la interfase agua/aire pudimos demostrar mediante microscopía de fluorescencia Confocal usando tres sondas fluorescentes con deferentes mecanismos de partición hacia estructuras fibrilares de proteínas (ThT) y fases lipídicas (Laurdan y DiI-C18) en las que los péptidos Melittin quedan embebidos y revestidos debido a su peculiar interacción con el lípido DSPC (estado líquido-condensado). Este proceso es moldeado en la interfase agua/aire y las estructuras en forma de nano-cables formadas permanecen estables por varias horas incluso después de ser transferidas a un soporte de mica. Además, pueden ser aisladas luego de ser transferidas a la mica utilizando la fuerza de arrastre de una gota de agua que es depositada en su superficie, precisamente debido a la coexistencia de dos fases lipídicas (líquido-ordenado y líquido-desordenado) dentro de un mismo dominio que responden diferencialmente debido a sus calidades de agua.