Estudio de la interacción de péptidos bioactivos con lípidos
Date
2022-12-01Author
Bolaño Álvarez, Alain
Advisor
Fidelio, Gerardo Daniel
Metadata
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Establecer una relación molecular racional en la interacción lípido/péptidos bioactivos para entender la formación de amiloides en la interfase agua/aire. Las condiciones estudiadas incluyen estabilidad y miscibilidad lateral de mezclas lípido/péptido, secuencias, conformación y estructura secundaria que los péptidos adquieren en la superficie y su capacidad
de formar estructuras amiloideas con lípidos de diferentes estados físicos.
El lípido POPC en estado líquido-expandido y nano-organizado en monocapas lipídicas induce
estructuras fibrilares en los péptidos Aβ amiloides en la interfase agua/aire con una proporción
baja de péptido. Las imágenes de BAM mostraron claramente estructuras fibrilares 3D que son
ThT positivas y fueron bien visualizadas por AFM luego de transferir las nanoestructuras a un
soporte de mica. Por el contrario, cuando se utilizó DSPC (estado líquido-condensado) en la
mezcla con péptidos Aβ amiloides, el comportamiento lateral fue inmiscible sin formar
estructuras fibrilares.
Cuando se realizaron mezclas del péptido Aβ amiloide con el lípido DPPC, que sufre transición
bidimensional LE→LC la formación de las fibras depende claramente en qué región de fase se
encuentra DPPC, siendo favorecida en la fase LE e inhibida en la fase LC.
Los péptidos truncados Aβ(1-37/38/39) cuando se mezclaron a baja proporción (95:05) con el
lípido POPC no formaron fibras amiloides que pudieran ser claramente apreciables por BAM,
lo que indica la influencia crítica de tan solo un solo residuo en proceso de fibrilación. Sin
embargo, la reversión de la secuencia de los Aβ(1-40/42) en mezcla a baja proporción (95:05)
con POPC estableció una diferencia estructural marcada en las fibras formadas, apreciándose
en ambos casos estructuras fibrilares aisladas y oligómeros en comparación con los networks
visualizados cuando los péptidos utilizados estaban en su secuencia natural.
La fibrilación del péptido amiloide en la interfase agua/aire puede modularse dinámicamente
por la calidad del entorno acuoso de la fase lipídica, la proporción de la proteína en la mezcla,
el empaquetamiento lateral, así como la reversión de la secuencia de los péptidos amiloides y
el número de aminoácidos en el C-terminal del amiloide.
La mezcla fisiológica de gangliósidos totales fue capaz de disolver ensamblajes de estructuras
fibrilares inducidos por POPC en el péptido Aβ (1–40) en un sistema modelo de membrana
(monocapas de Langmuir). El análisis de imágenes BAM mostró ciertamente la disolución de
dominios redondeados ThT positivos y estructuras fibrilares distinguiéndose una fase más
homogénea en un entorno lipídico sin desorción de proteínas de la interfase. Este proceso puede
conceptualizarse como una transición cooperativa de la disposición supramolecular del Aβ
amiloide estructurado en forma de fibras, lo que es inducido por cambios en el entorno lipídico
desencadenados por los gangliósidos en la interfase. La fibrilación de amiloide inducida por POPC puro puede disolverse dinámicamente cuando los gangliósidos se mezclan lateralmente
con las estructuras fibrilares, pero preservando la disposición de la monocapa. Nuestros
resultados sugieren que la calidad de la superficie y las propiedades de los componentes
lipídicos interfaciales son importantes para que el péptido Aβ adquiera una estructura molecular
definida en un entorno de membrana.
El péptido Melittin induce auto-estructuración con la formación de dominios redondeados y
fibras tipo amiloides cuando se mezcla con el lípido DSPC de características líquidocondensado
en la interfase agua/aire, dependiendo de la proporción del área peptídica en la
mezcla. Las imágenes de monocapas mezclas tomadas con la técnica BAM mostraron
claramente estructuras fibrilares 3D y dominios redondeados en la interfase sin disolverse en la
subfase. Estas estructuras identificadas fueron marcadas peculiarmente con ThT destacando por
primera vez una disposición lípido/péptido en la interfase con un péptido (melittin) que tiene
propiedades antimicrobianas y no ha sido identificado como amiloide. Las estructuras también
se visualizaron por AFM y SEM luego de ser transferirlas a un soporte de mica. Dichas
estructuras fibrilares en la mezcla DSPC/Melittin (50:50) se caracterizan por cambios en el
reordenamiento molecular de péptidos y lípidos según las variaciones de señales vibracionales
observadas por ATR-FTIR, así como cambios en las longitudes de onda de emisión usando la
sonda ThT en microscopía de fluorescencia. Por lo tanto, podemos decir que la amiloidogénesis
no es un proceso restringido a péptidos Aβ amiloides, sino que puede manifestarse en péptidos
con propiedades antimicrobianas y tóxicas como melittin, además es modulado por el estado
físico de los lípidos. Por el contario este fenómeno de fibrilación no fue observable con el
lípido POPC en estado líquido-expandido, lo que indica que el grado de hidratación de los
componentes en la interfase es un factor importante para el efecto descrito.
Las estructuras fibrilares de la mezcla DSPC/Melittin en su superficie tienen un alto contenido
de lípidos DSPC según el análisis de reflectividad a partir de las imágenes de BAM incluso
cuando la PAP se aumentó ligeramente al 60%. Dada la peculiar organización y estabilidad de
esta mezcla en la interfase agua/aire pudimos demostrar mediante microscopía de fluorescencia Confocal usando tres sondas fluorescentes con deferentes mecanismos de partición hacia estructuras fibrilares de proteínas (ThT) y fases lipídicas (Laurdan y DiI-C18) en las que los
péptidos Melittin quedan embebidos y revestidos debido a su peculiar interacción con el lípido
DSPC (estado líquido-condensado). Este proceso es moldeado en la interfase agua/aire y las
estructuras en forma de nano-cables formadas permanecen estables por varias horas incluso
después de ser transferidas a un soporte de mica. Además, pueden ser aisladas luego de ser
transferidas a la mica utilizando la fuerza de arrastre de una gota de agua que es depositada en
su superficie, precisamente debido a la coexistencia de dos fases lipídicas (líquido-ordenado y
líquido-desordenado) dentro de un mismo dominio que responden diferencialmente debido a
sus calidades de agua.
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