Determinación del impacto de pesticidas organofosforados sobre la placenta humana a través de modelos in vitro

Abstract

La placenta cumple funciones vitales en la gestación del ser humano. Es el órgano que media la interrelación entre la madre y el individuo en gestación, permitiendo la implantación y la transferencia de nutrientes, hormonas y gases, así como de productos de desecho. Su desarrollo normal está directamente relacionado con el éxito del embarazo y la salud materno-fetal a corto y largo plazo. Consecuentemente, es de gran importancia investigar si la exposición maternal a contaminantes ambientales puede afectarla. En las últimas décadas, la exposición a pesticidas ha incrementado notablemente debido a su uso para proteger las cosechas y mantener los ambientes libres de insectos. En este sentido, los plaguicidas organofosforados (OP) forman parte de los insecticidas químicos de mayor uso. Sus efectos tóxicos más estudiados se deben a la inhibición de las enzimas acetilcolinesterasa (AchE) y esterasa neurotóxica, llevando a síntomas característicos de neurotoxicidad aguda y retardada respectivamente. Además, se han descripto otros mecanismos por los cuales los OP provocan una acción tóxica directa sobre distintos tejidos. Algunos estudios han reportado un aumento en el riesgo de alteraciones en el embarazo de mujeres expuestas a estos pesticidas, sin embargo, los resultados son controvertidos y muy pocos estudios han explorado si las células y funciones placentarias se ven afectadas por la presencia de OP. La principal limitación de los estudios poblacionales sobre los efectos de plaguicidas es la incapacidad de demostrar de manera absoluta la relación causa-efecto y de detectar daños que lleven a la pérdida muy temprana de un embarazo. Por lo tanto, los avances en este sentido requieren de su complementación con estudios in vitro que permitan individualizar los efectos de un tóxico en particular sobre las células y estructura de la placenta humana. En esta Tesis Doctoral se propuso caracterizar el efecto del pesticida OP Clorpirifos (CPF) sobre la placenta humana empleando modelos in vitro. La viabilidad de las líneas celulares trofoblásticas JEG-3 y BeWo, así como la de cultivos primarios de citotrofoblastos vellosos (CTBv), no se alteró marcadamente en los tratamientos con CPF en las condiciones ensayadas, sugiriendo que estas células poseen mecanismos de resistencia efectivos a dosis de CPF reportadas como citotóxicas en modelos de células neuronales. En comparación con los CTBv, las células HTR8/SV-neo, provenientes de citotrofoblastos extravellosos (CTBev), fueron más sensibles a CPF en concentraciones elevadas, mostrando una reducción en su viabilidad cercana al 35%. La diferenciación de los CTBv y la capacidad proliferativa, migratoria e invasiva de los CTBev no fueron significativamente alterados en condiciones de exposición al tóxico en las cuales se mantuvo la viabilidad celular. Sin embargo, CPF alteró la expresión de genes relevantes para la función placentaria. En los modelos celulares de trofoblastos vellosos, CPF indujo la transcripción de la subunidad í3 de la hormona gonadotropina coriónica (f3-hCG), de los transportadores de eflujo ABCG2 y glicoproteína P (P-gp), y del factor de transcripción específico de placenta GCM1. CPF generó también un aumento en la síntesis de 0-hCG y de los transportadores de eflujo evaluados y un aumento en la secreción de 13-hCG pero no de progesterona y estradiol. En el modelo de CTBev, se observó una disminución en la transcripción del receptor 1 del factor de crecimiento del endotelio vascular (FIti), así como, del factor inducible por hipoxia 1 alfa (HIF-la) y, a la mayor dosis evaluada, del factor de transcripción activado mediante unión a ligando PPARy y de 3-hCG. En relación a los factores moleculares potencialmente involucrados en los efectos de CPF sobre el trofoblasto velloso, se demostró que el aumento en la expresión de 3-hCG es parcialmente dependiente de las especies reactivas del oxígeno (EROs) generadas por el tóxico y del factor de transcripción tipo krüppel KLF6. En un trabajo en colaboración, se describió que CPF desencadena una respuesta antioxidante mediada, al menos en parte, por el factor de transcripción 2 relacionado al factor nuclear eritroide 2 (Nrf2). En esta tesis, se demostró que, de acuerdo a lo esperado, Nrf2 regula la expresión basa] de ABCG2 en las células JEG-3, sin embargo, tanto el aumento de 13-hCG como de ABCG2 inducido por CPF sería mediante un mecanismo independiente del mismo. Por otra parte, 3-hCG participaría en la homeostasis rédox de las células JEG-3, pero no sería necesaria para la sobrevida de las mismas en presencia de CPF, al menos en las condiciones de dosis y tiempo ensayadas. Finalmente, se evaluó el impacto de CPF sobre las vellosidades coriónicas, observándose marcadas alteraciones morfológicas a nivel de microscopía óptica y electrónica. CPF indujo alteraciones compatibles con modificación de la composición estromal y apoptosis de células intravellositarias; y engrosamiento de la membrana basa¡ y alteraciones en la disposición y morfología de núcleos de la barrera trofoblástica. Además, a RESUMEN la dosis del tóxico más elevada ensayada, se observó marcada desorganización vellositaria y daño tisular sugerente de necrosis trofoblástica. En conjunto los resultados indican que los trofoblastos vellosos poseen mecanismos de resistencia a la citotoxicidad por CPF, entre los cuales podemos incluir el incremento en la respuesta antioxidante, la producción de transportadores de eflujo y, posiblemente, el incremento de 13-hCG. Sin embargo, en la vellosidad coriónica existirían otros mediadores, celulares o no, más sensibles a la toxicidad del CPF, que inducirían daño tisular marcado incluso sobre el epitelio trofoblástico. Este estudio ha contribuido al conocimiento de los efectos de CPF sobre la placenta humana y de la respuesta del trofoblasto frente al pesticida; ha revelado nuevos blancos moleculares trofoblásticos que deberían ser considerados en la evaluación de las consecuencias de la exposición in vivo sobre el embarazo; y ha demostrado la importancia de abarcar diversos modelos experimentales para estudiar la toxicidad de un compuesto en particular sobre la placenta humana.

The placenta fulfills vital functions in human pregnancy. It is the interface between the mother and the unborn child, it aliows implantation, secretes hormones that maintain pregnancy, and mediates the exchange of nutrients and metabolic waste products. lts normal development is directly related to the success of pregnancy as well as to short- and long-term health of the mother and the fetus. Consequently, it is important to investigate whether maternal exposure to environmental contaminants can disturb its development or function. In recent decades, exposure to pesticides has significantly increased due to their use to protect crops and to keep insect-free environments. Organophosphorous (OP) pesticides are among the most widely used chemical insecticides. Their main toxic effect is the inhibition of the enzyme acetylcholinesterase (AChE) and neurotoxic esterase leading to characteristic symptoms of neurotoxicity. However, other mechanisms that cause a direct toxic action on various tissues have been described. Some studies have reported an increased risk of abnormal pregnancy in women exposed to these pesticides. However, the results are controversia¡ and few studies have explored whether cells and placental functions are affected by the presence of OP. The main limitation of population studies on the effects of pesticides is to unequivocally prove causeeffect and to detect damage that lead to early pregnancy loss. Therefore, progress in this regard requires in vitro studies in order to identify toxic effects partícula rly on the celis and structure of the human placenta. The aim of this Thesis was to characterize the effect of chlorpyrifos (CPF), the most widely used OP pesticide, on human placenta using in vitro modeis. Trophoblastic viability in JEG-3 and BeWo cell unes, and primary cultures of villous cytotrophoblast (CTBv), was not significantly altered in CPF treatments. The results suggest that villous trophoblasts have effective resistance mechanisms against doses of CPF that have been reported to be cytotoxic in neuron cell models. The HTR8/SV-neo cells, an extravillous cytotrophoblast (CTBev) cell model, were more sensitive to the cytotoxic effect at high concentrations, showing a cell viability reduction of about 35%. CTBv differentiation as well as proliferative, migratory and invasive capacity of CTBev were not significantly impaired in toxic exposure conditions where celi viability was maintained. However, CPF altered the expression of genes relevant for placental function. In the villous trophoblast celi models, CPF induced the transcription of the human chorionic gonadotropin 13 subunit (13-hCG), of the efflux transporters ABCG2 and P-glycoprotein (P-gp), and of the placenta specific transcription factor, GCM1. CPF also increased the synthesis of 13-hCG and the efflux transporters, as well as, the secretion of 13-hCG but not progesterone and estradiol. A decrease in the transcription of the vascular endothelial growth factor receptor-1 (Fiti) and the hypoxia-inducible factor-1 alpha (HIF-la), and, at high doses, of the transcription factor activated by ligand, PPARy, and 13-hCG were observed in the CTBev celi model. Regarding to the molecular factors potentiaily involved in the effects of CPF on villous trophoblast cells, the increased expression of 13-hCG was partially dependent on reactive oxygen species and on the Krüppel-like transcription factor 6, KLF6. In a collaborative research done during this thesis, it was described that CPF triggers an antioxidant response mediated, at least in part, by the Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2). In this thesis, we showed that, as expected, Nrf2 regulates the basal expression of ABCG2, however, both, the increase in 13-hCG and ABCG2 by CPF were induced by an Nrf2 independent mechanism. Qn the other hand, results suggest that 13-hCG participates in the redox homeostasis of JEG-3 cells but it is not necessary for celI survival in the presence of CPF, at least under the dose and time conditions assayed. Finally, the impact of CPF on chorionic villus was assessed. Clear morphological alterations were detected by optical and electron microscopy. They included modifications on stroma composition and increased intervillous cell apoptosis, basa¡ membrane enlargement and nuclear disposition and morphological alterations on trophoblasts. Also, at the highest assayed doses, clear villous disorganization and tissue damage were observed, suggesting trophoblast necrosis. Overall, the results of this Thesis indicate that villous trophoblast cells activate CPF cytotoxicity resistance mechanisms, among which we can include an increased antioxidant response, production of efflux transporters and, increased synthesis and secretion of 13-hCG. However, in the chorionic villus there are other cellular o acellular mediators, more sensitive to the toxicity of CPF, that may induce damage to the placenta. This study has contributed knowledge about CPF effects on the human placenta and on the trophoblast response to this pesticide; has revealed new molecular targets that should be considered in assessing the consequences of the in vivo exposure to CPF on pregnancy; and it has also demonstrated the importance of covering various experimental modeis for studying the toxicity of a particular compound on human placenta.