Determinación del impacto de pesticidas organofosforados sobre la placenta humana a través de modelos in vitro
Date
2015Author
Ridano, Magali Evelin
Advisor
Panzetta de Dutari, Graciela María Del Valle
Metadata
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La placenta cumple funciones vitales en la gestación del ser humano. Es el órgano
que media la interrelación entre la madre y el individuo en gestación, permitiendo la
implantación y la transferencia de nutrientes, hormonas y gases, así como de productos de
desecho. Su desarrollo normal está directamente relacionado con el éxito del embarazo y la
salud materno-fetal a corto y largo plazo. Consecuentemente, es de gran importancia
investigar si la exposición maternal a contaminantes ambientales puede afectarla.
En las últimas décadas, la exposición a pesticidas ha incrementado notablemente
debido a su uso para proteger las cosechas y mantener los ambientes libres de insectos. En
este sentido, los plaguicidas organofosforados (OP) forman parte de los insecticidas
químicos de mayor uso. Sus efectos tóxicos más estudiados se deben a la inhibición de las
enzimas acetilcolinesterasa (AchE) y esterasa neurotóxica, llevando a síntomas
característicos de neurotoxicidad aguda y retardada respectivamente. Además, se han
descripto otros mecanismos por los cuales los OP provocan una acción tóxica directa sobre
distintos tejidos.
Algunos estudios han reportado un aumento en el riesgo de alteraciones en el
embarazo de mujeres expuestas a estos pesticidas, sin embargo, los resultados son
controvertidos y muy pocos estudios han explorado si las células y funciones placentarias se
ven afectadas por la presencia de OP. La principal limitación de los estudios poblacionales
sobre los efectos de plaguicidas es la incapacidad de demostrar de manera absoluta la
relación causa-efecto y de detectar daños que lleven a la pérdida muy temprana de un
embarazo. Por lo tanto, los avances en este sentido requieren de su complementación con
estudios in vitro que permitan individualizar los efectos de un tóxico en particular sobre las
células y estructura de la placenta humana.
En esta Tesis Doctoral se propuso caracterizar el efecto del pesticida OP Clorpirifos
(CPF) sobre la placenta humana empleando modelos in vitro.
La viabilidad de las líneas celulares trofoblásticas JEG-3 y BeWo, así como la de
cultivos primarios de citotrofoblastos vellosos (CTBv), no se alteró marcadamente en los
tratamientos con CPF en las condiciones ensayadas, sugiriendo que estas células poseen
mecanismos de resistencia efectivos a dosis de CPF reportadas como citotóxicas en modelos
de células neuronales. En comparación con los CTBv, las células HTR8/SV-neo, provenientes
de citotrofoblastos extravellosos (CTBev), fueron más sensibles a CPF en concentraciones
elevadas, mostrando una reducción en su viabilidad cercana al 35%.
La diferenciación de los CTBv y la capacidad proliferativa, migratoria e invasiva de los
CTBev no fueron significativamente alterados en condiciones de exposición al tóxico en las
cuales se mantuvo la viabilidad celular. Sin embargo, CPF alteró la expresión de genes
relevantes para la función placentaria. En los modelos celulares de trofoblastos vellosos, CPF
indujo la transcripción de la subunidad í3 de la hormona gonadotropina coriónica (f3-hCG), de
los transportadores de eflujo ABCG2 y glicoproteína P (P-gp), y del factor de transcripción
específico de placenta GCM1. CPF generó también un aumento en la síntesis de 0-hCG y de
los transportadores de eflujo evaluados y un aumento en la secreción de 13-hCG pero no de
progesterona y estradiol. En el modelo de CTBev, se observó una disminución en la
transcripción del receptor 1 del factor de crecimiento del endotelio vascular (FIti), así como,
del factor inducible por hipoxia 1 alfa (HIF-la) y, a la mayor dosis evaluada, del factor de
transcripción activado mediante unión a ligando PPARy y de 3-hCG.
En relación a los factores moleculares potencialmente involucrados en los efectos de
CPF sobre el trofoblasto velloso, se demostró que el aumento en la expresión de 3-hCG es
parcialmente dependiente de las especies reactivas del oxígeno (EROs) generadas por el
tóxico y del factor de transcripción tipo krüppel KLF6. En un trabajo en colaboración, se
describió que CPF desencadena una respuesta antioxidante mediada, al menos en parte, por
el factor de transcripción 2 relacionado al factor nuclear eritroide 2 (Nrf2). En esta tesis, se
demostró que, de acuerdo a lo esperado, Nrf2 regula la expresión basa] de ABCG2 en las
células JEG-3, sin embargo, tanto el aumento de 13-hCG como de ABCG2 inducido por CPF
sería mediante un mecanismo independiente del mismo. Por otra parte, 3-hCG participaría
en la homeostasis rédox de las células JEG-3, pero no sería necesaria para la sobrevida de las
mismas en presencia de CPF, al menos en las condiciones de dosis y tiempo ensayadas.
Finalmente, se evaluó el impacto de CPF sobre las vellosidades coriónicas,
observándose marcadas alteraciones morfológicas a nivel de microscopía óptica y
electrónica. CPF indujo alteraciones compatibles con modificación de la composición
estromal y apoptosis de células intravellositarias; y engrosamiento de la membrana basa¡ y
alteraciones en la disposición y morfología de núcleos de la barrera trofoblástica. Además, a
RESUMEN
la dosis del tóxico más elevada ensayada, se observó marcada desorganización vellositaria y
daño tisular sugerente de necrosis trofoblástica.
En conjunto los resultados indican que los trofoblastos vellosos poseen mecanismos
de resistencia a la citotoxicidad por CPF, entre los cuales podemos incluir el incremento en la
respuesta antioxidante, la producción de transportadores de eflujo y, posiblemente, el
incremento de 13-hCG. Sin embargo, en la vellosidad coriónica existirían otros mediadores,
celulares o no, más sensibles a la toxicidad del CPF, que inducirían daño tisular marcado
incluso sobre el epitelio trofoblástico.
Este estudio ha contribuido al conocimiento de los efectos de CPF sobre la placenta
humana y de la respuesta del trofoblasto frente al pesticida; ha revelado nuevos blancos
moleculares trofoblásticos que deberían ser considerados en la evaluación de las
consecuencias de la exposición in vivo sobre el embarazo; y ha demostrado la importancia
de abarcar diversos modelos experimentales para estudiar la toxicidad de un compuesto en
particular sobre la placenta humana.
The placenta fulfills vital functions in human pregnancy. It is the interface between
the mother and the unborn child, it aliows implantation, secretes hormones that maintain
pregnancy, and mediates the exchange of nutrients and metabolic waste products. lts
normal development is directly related to the success of pregnancy as well as to short- and
long-term health of the mother and the fetus. Consequently, it is important to investigate
whether maternal exposure to environmental contaminants can disturb its development or
function.
In recent decades, exposure to pesticides has significantly increased due to their use
to protect crops and to keep insect-free environments. Organophosphorous (OP) pesticides
are among the most widely used chemical insecticides. Their main toxic effect is the
inhibition of the enzyme acetylcholinesterase (AChE) and neurotoxic esterase leading to
characteristic symptoms of neurotoxicity. However, other mechanisms that cause a direct
toxic action on various tissues have been described.
Some studies have reported an increased risk of abnormal pregnancy in women
exposed to these pesticides. However, the results are controversia¡ and few studies have
explored whether cells and placental functions are affected by the presence of OP. The main
limitation of population studies on the effects of pesticides is to unequivocally prove causeeffect
and to detect damage that lead to early pregnancy loss. Therefore, progress in this
regard requires in vitro studies in order to identify toxic effects partícula rly on the celis and
structure of the human placenta.
The aim of this Thesis was to characterize the effect of chlorpyrifos (CPF), the most
widely used OP pesticide, on human placenta using in vitro modeis.
Trophoblastic viability in JEG-3 and BeWo cell unes, and primary cultures of villous
cytotrophoblast (CTBv), was not significantly altered in CPF treatments. The results suggest
that villous trophoblasts have effective resistance mechanisms against doses of CPF that
have been reported to be cytotoxic in neuron cell models. The HTR8/SV-neo cells, an
extravillous cytotrophoblast (CTBev) cell model, were more sensitive to the cytotoxic effect
at high concentrations, showing a cell viability reduction of about 35%.
CTBv differentiation as well as proliferative, migratory and invasive capacity of CTBev
were not significantly impaired in toxic exposure conditions where celi viability was
maintained. However, CPF altered the expression of genes relevant for placental function. In
the villous trophoblast celi models, CPF induced the transcription of the human chorionic
gonadotropin 13 subunit (13-hCG), of the efflux transporters ABCG2 and P-glycoprotein (P-gp),
and of the placenta specific transcription factor, GCM1. CPF also increased the synthesis of
13-hCG and the efflux transporters, as well as, the secretion of 13-hCG but not progesterone
and estradiol. A decrease in the transcription of the vascular endothelial growth factor
receptor-1 (Fiti) and the hypoxia-inducible factor-1 alpha (HIF-la), and, at high doses, of the
transcription factor activated by ligand, PPARy, and 13-hCG were observed in the CTBev celi
model.
Regarding to the molecular factors potentiaily involved in the effects of CPF on villous
trophoblast cells, the increased expression of 13-hCG was partially dependent on reactive
oxygen species and on the Krüppel-like transcription factor 6, KLF6. In a collaborative
research done during this thesis, it was described that CPF triggers an antioxidant response
mediated, at least in part, by the Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2). In this
thesis, we showed that, as expected, Nrf2 regulates the basal expression of ABCG2,
however, both, the increase in 13-hCG and ABCG2 by CPF were induced by an Nrf2
independent mechanism. Qn the other hand, results suggest that 13-hCG participates in the
redox homeostasis of JEG-3 cells but it is not necessary for celI survival in the presence of
CPF, at least under the dose and time conditions assayed.
Finally, the impact of CPF on chorionic villus was assessed. Clear morphological
alterations were detected by optical and electron microscopy. They included modifications
on stroma composition and increased intervillous cell apoptosis, basa¡ membrane
enlargement and nuclear disposition and morphological alterations on trophoblasts. Also, at
the highest assayed doses, clear villous disorganization and tissue damage were observed,
suggesting trophoblast necrosis.
Overall, the results of this Thesis indicate that villous trophoblast cells activate CPF
cytotoxicity resistance mechanisms, among which we can include an increased antioxidant
response, production of efflux transporters and, increased synthesis and secretion of 13-hCG.
However, in the chorionic villus there are other cellular o acellular mediators, more sensitive
to the toxicity of CPF, that may induce damage to the placenta.
This study has contributed knowledge about CPF effects on the human placenta and
on the trophoblast response to this pesticide; has revealed new molecular targets that
should be considered in assessing the consequences of the in vivo exposure to CPF on
pregnancy; and it has also demonstrated the importance of covering various experimental
modeis for studying the toxicity of a particular compound on human
placenta.
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