Mecanismos moleculares asociados con el efecto inhibitorio de los anticuerpos anti-gangliósidos sobre la regeneración axonal en el sistema nervioso periférico

Abstract

Resumen: El síndrome de Guillain Barré (SGB) es una polineuropatía aguda caracterizada por la presencia de parálisis muscular ascendente y arreflexia. Al presente los mecanismos patogénicos no han sido dilucidados en su totalidad, pero se asume que la parálisis en pacientes con SGB donde se ven afectados los axones estaría relacionada al desarrollo de una respuesta autoinmune humoral contra gangliósidos. Se ha descripto que la presencia de altos títulos de anticuerpos anti-gangliósidos se asocia con una recuperación clínica más lenta y una mala prognosis. Resultados previos de nuestro grupo de trabajo han demostrado en modelos in vitro usando neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRGn) que los anticuerpos anti-gangliósidos inhiben la extensión de neuritas y provocan colapso del cono de crecimiento a través de la activación de vías tanto dependientes de la GTPasa RhoA y su quinasa asociada ROCK (mediante la alteración de la dinámica de microtúbulos y reducción de la extensión de filopodias) como independientes de RhoA (colapso de la lamela de actina). Así los anticuerpos anti-gangliósidos ejercen un rol inhibitorio sobre la regeneración axonal mediante la activación de una cascada de señalización que involucra la interacción de gangliósidos con moléculas transductoras específicas, lo que se traduce en la activación de vías dependientes e independientes de RhoA, que modulan en forma negativa el citoesqueleto de actina y tubulina de los conos de crecimiento de las neuronas estudiadas. Los objetivos del presente trabajo fueron determinar la/las posibles moléculas compañeras de los gangliósidos en la membrana, capaces de transducir el efecto inhibitorio de los anticuerpos anti-gangliósidos sobre el crecimiento neurítico en modelos in vitro e in vivo; y estudiar las vías de señalización que conducen a la activación de la GTPasa pequeña RhoA y a la inhibición de la regeneración axonal. Comenzamos con una búsqueda bibliográfica e informática de las proteínas que se encontraron en un estudio de proteómica para determinar posibles interacciones con gangliósidos. Luego empleando diferentes técnicas experimentales pudimos encontrar que los efectos inhibitorios de los anticuerpos específicos contra el gangliósido GD1a (αGD1a) sobre el crecimiento neurítico de DRGn son dependientes del receptor del factor de necrosis tumoral alfa 1a (TNFR1a) y que éste actúa como molécula transductora y compañero molecular del gangliósido GD1a en forma específica. Complementariamente se realizó un análisis in sílico de la estructura 3D de la región del tallo del TNFR1a con la finalidad de identificar posibles sitios de interacción con el gangliósido GD1a. Esto derivó en la identificación de una mutante del TNFR1a caracterizada por la sustitución de ácido aspártico por alanina en la posición 165 la cual fue capaz de prevenir la transducción de la señal de los anticuerpos αGD1a específicos. Determinamos que los anticuerpos αGD1a (ya sean específicos o crosreactivos) activan a RhoA a través de TNFR1a por una vía alternativa al desplazamiento RhoGDI/RhoA por el dominio intracelular de éste receptor. Esto nos llevó a estudiar otra vía de señalización alternativa relacionada con la activación de RhoA. Otro candidato encontrado en la proteómica y confirmado experimentalmente por participar en la vía de señalización inhibitoria de los anticuerpos anti-gangliósidos fue la subunidad alfa de tipo inhibitoria 2 de la proteína G heterotrimérica (Gαi2). Esta proteína se relaciona con la disminución de los niveles de AMP cíclico intracelular y en consecuencia no se activa la proteína quinasa A que ejerce un efecto modulatorio negativo sobre RhoA. Confirmamos que Gαi2 en DRGn está involucrada en la inhibición del crecimiento axonal, en el colapso rápido de la lamela de actina y en la activación de RhoA mediada por los anticuerpos αGD1a específicos y crosreactivos. Por otra parte, identificamos a la GTPasa Rac1 como otro candidato encontrado en el estudio de proteómica y ya había sido relacionado con las alteraciones del citoesqueleto del cono de crecimiento. Determinamos que la Gαi2 está involucrada en el rápido descenso en la actividad de Rac1, mediado por el anticuerpo αGD1a/GT1b y esto se asocia al colapso de la lamela de actina (proceso RhoA independiente). En conclusión, nuestros resultados identifican un nuevo mecanismo molecular de señalización intracelular relacionado con el efecto inhibitorio de anticuerpos αGD1a específicos sobre el crecimiento neurítico y la reparación nerviosa, lo que abre la posibilidad al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas tendientes a mitigar el daño degenerativo que caracteriza a un porcentaje importante de pacientes con SGB.

Abstract: Guillain-Barré Syndrome (GBS) is an acute polyneuropathy characterized by the presence of ascending muscle paralysis and arreflexia. The pathogenic mechanisms have not been fully elucidated, but it is assumed that the paralysis in patients with axonal forms of GBS is related to the development of a humoral autoimmune response against gangliosides. It has been described that the presence of high titers of anti-ganglioside antibodies is associated with a slower clinical recovery and poor prognosis. Previous results from our research group in in vitro paradigms of neurite outgrowth of dorsal root ganglion neurons (DRGn) have shown that anti-gangliosides antibodies inhibit neurite outgrowth and cause growth cone collapse through the activation of both dependent (alteration of microtubule dynamics and reduction of filopodia extension) and independent (collapse of lamella) RhoA pathways. Thus, anti-ganglioside antibodies exert an inhibitory role on axonal regeneration by activating a signalling cascade that involves the interaction of gangliosides with specific transducing molecules. This results in the negative modulation of actin and tubulin cytoskeleton on growth cones from the neurons in both RhoA dependent and independent manner. The goals of the present work were to determine the potential partner molecules of the gangliosides in the membrane, capable of transducing the inhibitory effect of the anti-gangliosides antibodies on neurite outgrowth and to study the signaling pathways that lead to the activation of the small GTPase RhoA resulting in inhibition of axonal regeneration. We first performed a bibliographic and bioinformatic search among proteins from a proteomic study to determine possible molecular partners for gangliosides. Then, using different experimental techniques, we were able to find that the inhibitory effects of anti-ganglioside GD1a (antibodies αGD1a) on neurite outgrowth of DRGn are dependent on the expression of Tumor Necrosis Factor alpha receptor 1a (TNFR1a), which acts as a specific transducing moleculepartner for GD1a ganglioside. In addition, we performed an in sílico analysis of the 3D structure of the TNFR1a stalk region in order to identify potential interaction sites with GD1a ganglioside. This led to the identification of a TNFR1a mutant characterized by an aspartic acid substitutionfor alanine at position 165 which was able to prevent the signal transduction of specific αGD1a antibodies. We also identified that αGD1a antibodies (either specific or cross-reactive) activate RhoA through TNFR1a by an alternative mechanism to RhoGDI/RhoA displacement via the intracellular domain of this receptor. This led us to study another alternative signalling pathway related to RhoA activation. Another candidate found in the proteomic study and experimentally confirmed to participate in the inhibitory signalling pathway of anti-ganglioside antibodies, was the inhibitory type 2 alpha subunit of the heterotrimeric G protein (Gαi2). This protein`srole is to decrease intracellular cyclic AMP levels and consequently, protein kinase A, which exerts a negative modulatory effect on RhoA. We confirmedin DRGn that Gαi2 is involved in the inhibition of axonal outgrowth, the rapid collapse of the actin lamella and RhoA activation triggered by specific and cross-reactive αGD1a antibodies. On the other hand, we identified that Gαi is involved in the early decrease of GTPase Rac1 activity mediated by the αGD1a/GT1b antibody, which precedes the collapse of the actin lamella (RhoA-independent process). In conclusion, our results identify a new molecular mechanism of intracellular signalling related to the inhibitory effect of specific anti-GD1a antibodies on neurite outgrowth and nerve repair, which opens the possibility of developing new therapeutic strategies aimed to mitigate the degenerative damage present in a significant percentage of GBS patients.