Participación de los receptores cannabinoides CB1 en la reinstalación de la preferencia condicionada a cocaína inducida por estrés en ratas: influencia en la homeostasis de glutamato en Núcleo Accumbens

Abstract

Resumen: La adicción a drogas de abuso es considerada una enfermedad crónica que afecta principalmente al sistema nervioso central y se caracteriza por la gran probabilidad de reincidencia o recaída al consumo de la droga, incluso después de un largo período de abstinencia. Además de los factores individuales de la persona adicta, los factores externos tales como la ocurrencia de eventos estresantes, contribuyen significativamente a la persistente vulnerabilidad a reincidir en el abuso de drogas, siendo este uno de los aspectos más problemáticos en el tratamiento de la adicción. En animales de laboratorio, el modelo de reinstalación ha resultado válido para estudiar el fenómeno de la recaída basándose en los fundamentos de los paradigmas conductuales de aprendizaje asociativo, tales como la autoadministración y la preferencia condicionada a un lugar asociado a la droga (CPP, por sus siglas en inglés). Resultados previos de nuestro y otros laboratorios demostraron robustamente que la exposición aguda a un estresor induce la reinstalación del CPP asociado a la administración de cocaína. Modelos como éste han generado un gran avance en el conocimiento de los mecanismos neurobiológicos que subyacen a la reinstalación inducida por diversos estímulos. Las investigaciones dentro del área de la neurociencia, acerca de la influencia del estrés sobre la recaída al consumo de cocaína, se han focalizado en el estudio de los circuitos neuronales comunes que subyacen a distintos comportamientos en respuesta tanto al estrés como a la droga. En relación a las áreas cerebrales involucradas, el Núcleo Accumbens (NAc), subdividido en dos áreas anatómica y fisiológicamente diferentes, Core y Shell, constituye un área fundamental en los procesos de recompensa de reforzadores naturales y de drogas de abuso. Si bien ambas estructuras participan de los procesos de aprendizaje y el control sobre las conductas apetitivas, sería el NAc Core el área crítica de integración de proyecciones glutamatérgicas y dopaminérgicas aferentes de otras áreas motoras y límbicas durante la etapa de reinstalación. En este sentido, un trabajo previo de nuestro laboratorio demostró el importante rol de los receptores glutamatérgicos de NAc Core, pero no Shell, en la reinstalación del CPP asociado a cocaína, luego de la exposición a estrés por inmovilización. Estos resultados son consistentes con numerosos estudios que demuestran que la neurotransmisión glutamatérgica en NAc Core cumple un rol crucial en la reinstalación de la conducta de búsqueda de cocaína. Más aún, numerosos estudios reportan la importancia de la homeostasis de glutamato en NAc y su impacto sobre otros procesos celulares que subyacen al comportamiento relacionado a la reinstalación. En este sentido, las investigaciones actuales hacen foco especialmente en las estrategias farmacológicas que puedan reestablecer la homeostasis de glutamato con el objetivo de prevenir la recaída. Estudios recientes reportan que el sistema cannabinoide endógeno, particularmente a nivel de los receptores CB1 (CB1Rs), cumple un rol clave en la modulación de los procesos de reforzamiento de las drogas de abuso, como así también en la modulación de los efectos del estrés. En relación a ésto, se ha observado, a través de diferentes manipulaciones farmacológicas, que los CB1Rs median la reinstalación de la conducta de búsqueda de psicoestimulantes, luego de una re-exposición a la droga o a claves ambientales asociadas. Teniendo en cuenta que los CB1Rs se expresan en las terminales nerviosas aferentes glutamatérgicas y/o GABAérgicas de NAc, se ha propuesto que los cannabinoides endógenos y exógenos podrían afectar la conducta de reinstalación por acción sobre estas terminales. Si bien los estudios realizados en preparados in vitro de NAc muestran que la activación de los CB1Rs es la que inhibe de manera directa la liberación presináptica de glutamato, en modelos in vivo también se reportan resultados inconsistentes con el mecanismo canónico y se propone que los CB1Rs podrían participar de la regulación de la homeostasis de glutamato a través de la inhibición de la liberación de glutamato no sináptico. Este último efecto sobre los niveles de glutamato extrasináptico ha sido asociado a la influencia de los CB1Rs en la recaída, al ejercer una influencia sobre otros receptores perisinápticos, específicamente los receptores metabotrópicos glutamatérgicos mGluR-2/3, que controlan la liberación sináptica de glutamato inducida por el estrés, la cual es necesaria para la expresión de la conducta de búsqueda de droga. Debido entonces a las inconsistencias encontradas entre resultados in vitro e in vivo, en relación a la modulación de los CB1Rs sobre los niveles de glutamato en el NAc y su influencia sobre la conducta de búsqueda de droga inducida por estrés, resulta importante profundizar en la comprensión de los mecanismos celulares y moleculares que subyacen al complejo rol de los CB1Rs. Para ello, en el presente trabajo se planteó combinar técnicas de neuropsicofarmacología y de neuroquímica cerebral para intentar dilucidar la relación entre el comportamiento de búsqueda de cocaína, bajo un modelo de reinstalación inducida por estrés, y los cambios en los niveles de glutamato extracelular de NAc, ambos bajo la influencia de la manipulación farmacológica localizada de los CB1Rs. De esta manera, el objetivo general del presente trabajo de tesis fue evaluar farmacológicamente la participación de los CB1Rs, administrando un antagonista o un agonista de tales receptores directamente en NAc Core o en NAc Shell, en la reinstalación de la preferencia condicionada a cocaína inducida por la exposición aguda a estrés por inmovilización; y la influencia de dicha manipulación farmacológica sobre los niveles de glutamato extracelular, en las áreas mencionadas, determinados a partir de muestras colectadas a través de la técnica de microdiálisis in vivo. Los experimentos del presente trabajo de tesis fueron realizados con ratas adultas macho de la cepa Wistar. El protocolo general de reinstalación del CPP inducida por estrés consistió en el condicionamiento de los animales con cocaína (10 mg/kg i.p.) a uno de los dos contextos del aparato de CPP, durante ocho sesiones alternadas entre la droga y la administración de solución salina en el compartimento opuesto. Una vez demostrada la preferencia por el compartimento asociado a cocaína, los animales fueron sometidos a la extinción de dicha preferencia, mediante sucesivas asociaciones entre la administración de solución salina y ambos contextos del aparato de CPP. Para evaluar la reinstalación, el día posterior al test de extinción los animales recibieron una microinyección bilateral en NAc Core o en NAc Shell con un antagonista CB1R (AM251; 2,5 o 5 nmol/0,5 μl/lado), un agonista CB1R (ACEA; 0,01 o 0,001 fmol/0,5 μl/lado) o solución vehículo (VEH), según el experimento, y seguidamente fueron asignados a los siguientes tratamientos: 1) Estrés: inmovilización durante 15 ó 30 min según el experimento; 2) No estrés: permanencia en las cajas-hogar. Inmediatamente después, todos los animales fueron re-expuestos al aparato de CPP durante 15 min para evaluar el tiempo de permanencia en cada uno de los compartimentos. Los resultados obtenidos en el presente estudio mostraron, por un lado, que la microinyección de AM251 en su dosis más alta en NAc Core, pero no en Shell, inmediatamente antes de la exposición a estrés por inmovilización de 30 min, previno la reinstalación del CPP asociado a cocaína, la cual sí pudo observarse en los otros grupos sometidos a estrés, tanto administrados con VEH como con AM251 en una dosis más baja. Por otro lado, la activación de los CB1Rs mediante la microinyección local de ACEA en su dosis más alta, directamente en NAc Core, pero no Shell, indujo reinstalación del CPP al ser combinada con una sesión de estrés que por sí sola no induce aumento de la preferencia condicionada (15 min de inmovilización). Estos resultados parciales demuestran que los CB1Rs de NAc Core, pero no de Shell, participan en la reinstalación del CPP a cocaína inducida por la exposición al estrés por inmovilización. Por otra parte, teniendo en cuenta las evidencias que resaltan el rol modulador de los CB1Rs de NAc en la neurotransmisión glutamatérgica y que los receptores glutamatérgicos de NAc Core, pero no Shell, participan en la reinstalación inducida por estrés, se sugiere que los CB1Rs tienen una estrecha relación funcional con el sistema glutamatérgico en NAc Core para mediar el comportamiento de búsqueda de droga, bajo nuestro protocolo experimental. Para demostrar esto, en el presente trabajo de tesis se desarrolló un modelo de monitoreo in vivo de los niveles de glutamato extracelular de NAc Core en la reinstalación del CPP el cual permitió determinar una correlación entre la conducta de preferencia por un contexto asociado a la droga y el cambio en los niveles de glutamato extracelular luego del estrés. Específicamente, en ratas que extinguieron el CPP asociado a cocaína, el estrés por inmovilización indujo un aumento en los niveles de glutamato extracelular en NAc Core solo durante la re-exposición al contexto asociado con la droga, pero no al no asociado. De manera interesante, este aumento de glutamato dependiente del contexto fue suprimido en el grupo de animales que recibió previamente una microinyección de AM251 directamente en NAc Core. Además, un aumento similar en los niveles de glutamato extracelular en NAc Core fue observado cuando los animales fueron administrados localmente con ACEA inmediatamente antes de una sesión de estrés sub-umbral. En conjunto, estos experimentos aportan evidencias acerca del mecanismo glutamatérgico que subyace a la participación de los CB1Rs en la reinstalación de la preferencia condicionada a cocaína inducida por estrés. Con el objetivo de evaluar si la homeostasis de glutamato en NAc Core se ve comprometida al activar farmacológicamente a los CB1Rs, se diseñó un experimento en donde cada animal recibió dosis crecientes de ACEA, el agonista de CB1R, a través de la membrana de microdiálisis ubicada en NAc Core, mientras permanecía en su caja-hogar sin exposición a ningún otro estímulo en particular. De esta manera, demostramos que ACEA tiene la capacidad de disminuir los niveles basales (no inducidos por estímulo) de glutamato en NAc Core. Estos hallazgos pueden relacionarse con las evidencias previas que demuestran que la disminución en los niveles basales de glutamato extracelular en NAc promueven la reinstalación de la búsqueda de cocaína y que la misma puede ser prevenida si estos niveles se normalizan, probablemente por una falta de tono inhibitorio de los auto-receptores glutamatérgicos mGluR-2/3, los cuales modulan negativamente la liberación de glutamato inducida por cocaína y la conducta de búsqueda de droga. El presente trabajo demuestra que la manipulación farmacológica de los CB1Rs en nuestro modelo regula directamente los niveles basales (no inducidos por estímulo) de glutamato e influye en los niveles de glutamato medidos luego del estrés y en el contexto asociado a la droga (inducidos por estímulo). También queda demostrado que tal influencia está estrechamente relacionada con la la conducta de preferencia condicionada en animales que previamente extinguieron tal aprendizaje. En conclusión, los resultados del presente estudio demuestran que la participación de los CB1Rs sobre la reinstalación de la preferencia condicionada a cocaína inducida por estrés, se asocia a la modulación que ejercen estos receptores sobre la liberación de glutamato en NAc Core, la cual cumple un rol clave en el comportamiento de búsqueda de droga. Este estudio proporciona una plataforma para continuar investigando los mecanismos que subyacen a la participación de los CB1Rs en la reinstalación de la búsqueda de droga inducida por estrés. Cabe destacar que los estudios de microdiálisis in vivo como el nuestro, en combinación con técnicas farmacológicas y comportamentales, resultan de gran importancia para el estudio de los mecanismos de neuroplasticidad relacionados con la adicción, significando un medio valioso en el descubrimiento de nuevas estrategias de prevención y tratamiento de los cambios inducidos por las drogas y eventos estresantes.