Caracterización genotípica de cepas de Mycobacterium tuberculosis aisladas de muestras clínicas de personas privadas de la libertad en una cárcel de Córdoba, Argentina

Abstract

Resumen: La tuberculosis (TB) sigue siendo una enfermedad frecuente y grave en el Siglo XXI. Las cárceles son instituciones con altos números de casos de TB debido a sus condiciones de higiene y habitabilidad. El conocimiento acabado de las cepas circulantes en las cárceles puede colaborar al mayor entendimiento y control de la enfermedad. Se realizó un estudio descriptivo, observacional, transversal y retrospectivo. Se incluyó en el muestreo ocho cepas de Mycobacterium tuberculosis recuperadas de muestras clínicas de personas privadas de la libertad en la cárcel de Bouwer, Córdoba, Argentina y atendidas en el Hospital Rawson de Córdoba en el período desde enero de 2010 hasta julio de 2017. Se realizó examen directo y cultivo de las muestras en el Laboratorio de la División Microbiología del Hospital Rawson de Córdoba. La identi cación de género y especie se condujo en el Laboratorio Regional de la Tuberculosis, Hospital Tránsito Cáceres de Allende, Córdoba. La genotipi cación se realizó en el Servicio Micobacterias de la Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud “Dr. Carlos G. Malbrán” (A.N.L.I.S.), Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Cuatro cepas tuvieron un 100% de homología entre sí, una cepa estaba altamente relacionada con las anteriores y tres cepas correspondían a genotipos no relacionados con los primeros ni entre sí. Es necesario ampliar el número de aislamientos estudiados y realizar un estudio epidemiológico profundo a los nes de poder trazar la cadena epidemiológica de la TB dentro de la cárcel a n de optimizar los programas de control de la Introducción: La tuberculosis (TB) en el siglo XXI sigue siendo una enfermedad frecuente y grave a pesar de ser bien conocida, poder ser prevenida y existir técnicas de diagnóstico y tratamiento efectivas1. Afecta principalmente a grupos económicamente desfavorecidos y socialmente marginados por lo que su tasa de incidencia es muy elevada en países y regiones de escasos recursos, especialmente en las grandes ciudades e instituciones cerradas2. Las cárceles son reconocidas internacionalmente como instituciones con alto número de casos de TB donde la transmisión está determinada por el contacto entre internos, personal y/o contactos externos enfermos con otros sanos2,3,4. El hacinamiento, la mala ventilación, la falta de exposición a la luz natural y, en muchos casos, la falla en la implementación de programas institucionales efectivos de control de la TB en este tipo de instituciones constituyen factores determinantes para la propagación de la enfermedad en el ámbito carcelario5,6,7. La incidencia de TB en prisiones de América Latina es 22,2 veces mayor que en la población general lo cual las constituye en sitios de reservorio, concentración y diseminación de la enfermedad5,8. El acabado conocimiento de las cepas de M. tuberculosis circulantes en las cárceles, así como el mejoramiento de las condiciones de reclusión y la correcta implementación de programas institucionales de control y manejo de la TB pueden colaborar en la contención de la enfermedad tanto en los centros penitenciarios como en las comunidades en que se enclavan9,10. La genotipi cación de los aislamientos de M. tuberculosis contribuye al establecimiento de vínculos epidemiológicos entre cepas, detectando posibles brotes no sospechados, contaminación cruzada en el laboratorio y distinguiendo entre reactivaciones de la enfermedad y posibles reinfecciones11. En las últimas décadas se utilizó como gold standard para la tipi cación genotípica de cepas de M. tuberculosis la técnica de detección de polimor smos en el largo del fragmento de restricción IS6110 (IS6110 Restriction Fragment Lenght Polymor sm -RFLP-), secuencia de nucleótidos altamente conservada en la especie y reconocible por enzimas de restricción (endonucleasas), permitiendo detectar las diferencias entre linajes12. Sin embargo, esta técnica de ampli cación de ácidos nucleicos mediante reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction -PCR-) seguida de digestión de los fragmentos de ADN mediada por enzimas de restricción que cortan las hebras de material genético escindiendo las regiones IS6110 para su posterior estudio, posee grandes limitaciones en cuanto a tiempos de reacción y puri cación que pueden llevar semanas, con un intensivo trabajo en el laboratorio y alta complejidad en la interpretación de los resultados de los patrones de bandas obtenidos mediante electroforesis en gel de agarosa11. La genotipi cación basada en números variables de repeticiones en tándem (Variable Numbers of Tandem Repeats – VNTR-) de diferentes clases de elementos genéticos intercalados en el ADN micobacteriano, llamados unidades repetitivas intercaladas micobacterianas (Mycobacterial Interspersed Repetitive Units -MIRUs-), es utilizada cada vez con mayor frecuencia para evitar las di cultades de la RFLP13. Esta técnica mixta se basa en la ampli cación de múltiples elementos genéticos del ADN bacteriano mediante la combinación con sondas de hibridación (primers) especí cas y la posterior determinación del tamaño de los amplicones mediante electroforesis en capilares o geles o mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (High Performance Liquid Chromatography -HPLC-)11. Esta exibilidad en la técnica sumada a la posibilidad de trabajar con extractos crudos (sin necesidad de digestión mediante enzimas de restricción) de colonias nacientes en los cultivos la vuelven considerablemente más rápida que la técnica de RFLP. Asimismo, la interpretación de los resultados es menos di cultosa ya que se obtienen códigos numéricos asociados a cada primer utilizado y la comparación se torna más sencilla14. Adicionalmente, la tipi cación genotípica basada en la detección de espaciadores de oligonucleótidos (Spacer Oligonucleotide Typing -Spoligotyping-) es una técnica de PCR rápida y precisa orientada a la detección de un locus cromosómico especí co, la región “Direct Repeat” (DR), presente únicamente en las especies del complejo Mycobacterium tuberculosis. En la especie M. tuberculosis la región DR se compone de 36 pares de bases separadas por 43 espaciadores altamente conservados. Mediante la utilización de primers especí cos dirigidos a la región DR se produce la primera ampli cación de los espaciadores. Los oligonucleótidos obtenidos (marcados con moléculas de biotina) son jados mediante hibridización a una membrana activada con oligonucleótidos complementarios de secuencia conocida. Posteriormente esta membrana es incubada en una solución de estreptavidina-peroxidasa. La combinación de biotina y estreptavidina produce la liberación de una señal lumínica que puede ser detectada por autorradiografía o quimioluminiscencia. De este modo se obtiene a partir de la membrana un patrón de puntos de hibridación que es comparado con un patrón de los 43 espaciadores conocidos, detectando la presencia o ausencia de aquellos y permitiendo determinar el linaje de la cepa en estudio15. Los datos obtenidos mediante ambas técnicas de genotipi cación pueden ser ingresados en bases de datos internacionales para su análisis e interpretación. Shared International Type (SIT) es una base de datos online mundial de marcadores moleculares de cepas de M. tuberculosis16 que otorga una clasi cación o “tipo” de cepa y permite identi car a qué linaje pertenece. Fue creada en el año 1997 y cuenta con más de 87.000 aislamientos catalogados, provenientes de 160 países. Esta información es fundamental a la hora de trazar la evolución y epidemiología de la transmisión de la enfermedad y de conocer los linajes prevalentes y emergentes en cada región para proyectar futuras expansiones. De esta manera, la combinación de técnicas rápidas y de sencilla aplicación permite la identi cación genotípica de cepas de M. tuberculosis con alta especi cidad y precisión. El objetivo del presente trabajo es caracterizar genotípicamente las cepas de Mycobacterium tuberculosis aisladas enfermedad en esa población