Estudio de metodologías de extracción y purificación de ADN de alimentos para amplificación por PCR

Abstract

En los últimos años distintos países, incluido Argentina, han avanzado con reglamentaciones para garantizar la inocuidad alimentaria. Varios métodos moleculares se han propuesto como herramientas útiles para el análisis de alimentos. A pesar de que los métodos basados en el ADN, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) son altamente específicos, reproducibles, sensibles y caracterizados por el alto poder de discriminación, están fuertemente limitados por la presencia de inhibidores, abundantes en particular en muestras de alimentos. Los compuestos inhibitorios pueden interferir en la reacción a diferentes niveles, desde disminución de la eficiencia hasta una inhibición completa de la actividad de la ADN polimerasa. Por lo tanto, los métodos basados en ADN son altamente dependientes de las técnicas de extracción y purificación del ADN. En particular, los métodos moleculares aplicados a muestras de alimentos requieren estrategias de extracción y purificación eficiente de los ácidos nucleicos y la remoción de numerosos compuestos inhibidores de PCR. En este trabajo se han explorado cuatro estrategias de extracción y purificación del ADN, dos con kits comerciales, Núcleo Spin Food -Macherey-Nagel y Wizard Magnetic DNA Purification System for Food-Promega, y dos métodos estándares, CTAB (bromuro de cetil-trimetil amonio) y CTAB-PVP (bromuro de cetil-trimetil amonio con adición de polivinil pirrolidona). Se tuvo en cuenta el rendimiento de la extracción, la pureza del ADN y la amplificabilidad del ADN por qPCR. Se realizó la extracción y purificación de ADN por triplicado de quince alimentos procesados de diferente naturaleza y disponibles comercialmente (como por ejemplo galletitas, snacks, chocolate, medallones de pollo, jugo de frutas, etc). El ADN purificado se cuantificó por espectrofotometría UV a 260nm y la calidad se estimó por la relación UV 260/280nm. A su vez, se seleccionaron algunas muestras que pudieran contener ADN de maní, según su proceso de elaboración y/o la declaración en su rotulación, para ser amplificadas por qPCR y estimar si el ADN obtenido es factible de ser utilizado con este fin. Las estrategias de extracción y purificación evaluadas en este XII trabajo mostraron concentraciones de ADN muy variables, con buen rendimiento con el método de CTAB y aún mayor con su modificación de adición de PVP, respecto de los kits comerciales ensayados. En cuanto a la pureza del ADN extraído, los kits comerciales resultaron con mejor prestación principalmente en aquellas muestras pertenecientes al grupo de los panificados (galletitas y snacks). La amplificación por qPCR de las muestras ensayadas, que contenían maní entre sus ingredientes, fueron inhibidas en aquellas extraídas con CTAB versus las obtenidas con Núcleo Spin Food, en concordancia con la mayor purificación y eliminación de inhibidores por parte de los kits comerciales. Se obtiene ADN amplificable, en cantidad y pureza diferentes que permite detectar ADN de maní y potencial presencia del alérgeno; estos resultados evidencian la necesidad de continuar evaluando la amplificación por qPCR de diferentes regiones blanco de interés, información que complementará la elección de la estrategia de extracción y purificación del ADN para los diversos grupos de muestras problema.