El mecanismo de respuesta al estrés oxidativo de Streptococcus pneumoniae : su rol en la inducción de persistencia a las fluoroquinolonas

Abstract

El fallo de los tratamientos antibióticos es un problema preocupante de la medicina moderna. Durante los tratamientos antibióticos, en algunos casos ocurre que no se logra la eliminación completa de la población bacteriana que produce la enfermedad, y que sobrevivan subpoblaciones que toleran los antibióticos por mucho más tiempo. Esto provoca que estas subpoblaciones estén en contacto con el antibiótico más tiempo que las bacterias sensibles, lo que podría generar la evolución de resistencia a antibióticos. En ese sentido, se ha definido como persistencia a los antibióticos, a la habilidad de una subpoblación bacteriana de sobrevivir a una concentración de antibiótico que sería letal para la mayoría de la población. Se han descripto varios factores que pueden inducir persistencia, tales como variaciones en el pH, lisis osmótica, disminución de nutrientes, crecimiento de la bacteria en presencia de biofilm, otros antibióticos y estrés oxidativo. En esta tesis se reporta por primera vez la persistencia a fluoroquinolonas (FQs) inducida por estrés oxidativo. Streptococcus Pneumoniae (Spn) es una bacteria gram-positiva que tiene un impacto significativo en la salud humana. Es el agente causal de diversas afecciones, que van desde otitis y sinusitis hasta enfermedades graves como la neumonía adquirida en la comunidad, sepsis y meningitis. Este patógeno coloniza naturalmente la nasofaringe humana y, en ciertas condiciones, puede activar una infección más severa para producir una enfermedad. Durante este proceso, la bacteria puede adherirse a las células epiteliales, y desencadenar eventos de internalización e invasión de las células infectadas, enfrentándose a diversas condiciones adversas impuestas por la célula huésped, como el estrés oxidativo. Las FQs son antibióticos bactericidas que pueden penetrar los tejidos celulares y son utilizados para el tratamiento de infecciones neumocócicas, principalmente en adultos. En cuanto a su mecanismo de acción en Spn, se ha propuesto que las FQs producen daño al DNA cromosomal mediante la inhibición de la ADN girasa, pero principalmente inducen la producción de las especies reactivas del oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés Reactive Oxigen Species) lo que provoca la muerte de la célula bacteriana. El objetivo general de esta tesis es estudiar los genes que controlan la supervivencia intracelular de Spn en neumocitos, macrófagos y neutrófilos, su contribución en el mecanismo de resistencia al estrés oxidativo del neumococo, y en el mecanismo de persistencia a antibióticos. Para abordar dicho objetivo general, esta tesis está dividida en dos partes. En la primera parte, se demostró que la persistencia a las FQs en Spn se origina por el estrés oxidativo inducido durante la infección de diferentes modelos celulares. La exposición previa a estrés oxidativo actúa como una protección para los neumococos frente a los efectos perjudiciales causados por los elevados niveles de ROS inducidos por las FQs. En este mecanismo de inducción de persistencia a FQs se demostró que están involucrados genes tales como sodA, tpxD y spxB, los cuales tienen un rol en el mecanismo de defensa contra el estrés oxidativo en Spn. Observamos que Spn desarrolla esta persistencia durante su vida intracelular en células hospedadoras, y su inducción depende del nivel de estrés oxidativo presente en las mismas. Además, nuestros hallazgos indican que la persistencia podría influir en el resultado de la terapia antibiótica y formar parte de la evolución de la resistencia a las fluoroquinolonas. En nuestro laboratorio se reportó que el sinergismo que existe entre el virus influenza AV (IAV) y Spn incrementa la sobrevida intracelular bacteriana en un modelo de coinfección celular en neumocitos. El estrés oxidativo causado en las células hospedadoras afecta la sobrevida intracelular de Spn. Debido a la relación que existe entre el estrés oxidativo y persistencia a las FQs, en la segunda parte de esta tesis se analizó la persistencia a las FQs en un contexto de coinfección IAV/Spn, como así también los factores que pudieran estar induciendo este fenotipo. En efecto se demostró que en neumocitos, macrófagos y neutrófilos coinfectados con IAV/Spn, la persistencia a FQs se incrementa, lo que puede ser causado por la inhibición de la formación del autolisosoma, como así también por el estrés oxidativo inducido por la infección viral en las células coinfectadas. Además, se observó que los genes sodA, psaB, nrdH y clpL son controlados por el regulador de respuesta SirR, y que a su vez están involucrados en la respuesta al estrés oxidativo del neumococo y en el mecanismo de persistencia a FQs en células hospedadoras coinfectadas. De hecho, demostramos un mecanismo de inducción de persistencia intracelular en células coinfectadas con influenza A, en el que los neumococos levo-persoistentes se benefician de la inhibición de la formación de autolisosomas y del estrés oxidativo inducido por la infección viral. Por los resultados obtenidos, esta tesis constituye un aporte al conocimiento de los mecanismos de persistencia a los antibióticos en bacterias, y describe por primera vez un mecanismo de inducción de persistencia a las FQs en Spn.

The failure of antibiotic treatments is a significant problem in modern medicine. During antibiotic treatments, it is quite common that the complete elimination of the bacterial population is not achieved. The subpopulations that tolerate antibiotics for much longer can survive. This results in these subpopulations being exposed to the antibiotic for a longer time than sensitive bacteria, which could be one of the causes of the evolution of resistance and antimicrobial treatment failure. In this regard, persistence to antibiotics has been defined as the ability of a bacterial subpopulation to survive at an antibiotic concentration that would be lethal for majority of the population. Several factors have been described that can induce persistence: variations in pH, osmotic lysis, nutrient depletion, bacterial growth in the presence of biofilm, other antibiotics, and oxidative stress. In this thesis, we will demonstrate for first time the induction of persistence to fluoroquinolones in Streptococcus pneumoniae (Spn). Spn is a Gram-positive bacterium that has a significant impact on human health. It is the causative agent of various conditions, ranging from otitis and sinusitis to serious diseases such as community-acquired pneumonia, sepsis, and meningitis. This pathogenic bacterium is a natural colonizer of the human nasopharynx and, under certain conditions, can spread to the lungs and even enter the systemic bloodstream. During this process, the bacterium can adhere to epithelial cells and trigger events of internalization and invasion. During this latter stage, Spn can survive to adverse conditions imposed by the host cell, such as oxidative stress. FQs are bactericidal antibiotics used for the treatment of pneumococcal infections mainly in adults. They can penetrate cellular tissues and have been linked to oxidative stress by several authors, who hypothesize that the induction of ROS can act as a synergistic mechanism, together with the inhibition of DNA gyrase, to cause bacterial death. For this reason, the general objective of this thesis is to study the genes that control the intracellular survival of Spn in pneumocytes, macrophages, and neutrophils, their contribution to the pneumococcus's oxidative stress resistance mechanism, and the mechanism of persistence to antibiotics. This general objective going to be address in two parts. In the first part, we showed that the persistence of fluoroquinolones in Spn arises from two factors: arrested growth and oxidative stress induced during infection in various cellular models. Prior exposure to oxidative stress acts as protection for pneumococci against the harmful effects caused by the high levels of ROS induced by fluoroquinolones. We observed that S. pneumoniae develops this persistence during an infection, and its manifestation depends on the level of oxidative stress present in host cells, suggesting that its short lifespan inside cells contributes to this mechanism. It was demonstrated that the sodA, tpxD, and spxB genes are involved In the FQ persistence mechanism, and these genes play a role in the defense against oxidative stress in Spn. We observed that Spn develops this persistence during infection of host cells, and its development depends on the oxidative stress level present at intracellular level, suggesting that its brief lifespan within the host cells contributes to this mechanism. Furthermore, our findings indicate that FQ persistence could influence the outcome of antibiotic therapy and be part of the resistance evolution of fluoroquinolones. On the other hand, it has been demonstrated by other authors and our laboratory that IAV can increase Spn survival. Once of the factors that plays a fundamental role during viral coinfection is the proper maintenance of a pro-antioxidant balance. However, it is known that the oxidative stress caused by viral infection disrupts this balance, leading to significant changes in the host defense system. Due to the connection between oxidative stress and the intracellular persistence of fluoroquinolones, we were motivated in the second part to investigate whether the persistence to fluoroquinolones was heightened in the context of viral coinfection with Influenza A virus, and to identify the factors that might be causing this phenotype. We also observed that genes sodA, psaB, nrdH, and clpL, which are regulated by the response regulator SirR, and are involved in the pneumococcus's response to oxidative stress, are implicated in the intracellular persistence mechanism in co-infected cells. Indeed, we demonstrated a mechanism of induction of intracellular persistence in cells coinfected with Influenza A, in which fluoroquinolone-persistent pneumococci benefit from the inhibition of autolysosome formation and oxidative stress induced by viral infection. This thesis contributes to the understanding of mechanisms of FQ persistence in bacteria and describes for the first time a mechanism of induction of persistence to fluoroquinolones in Spn.