Efectos de las isoformas de prolina deshidrogenasa de Arabidopsis ProDH1 y ProDH2 sobre la homeostasis redox de diferentes compartimentos subcelulares

Abstract

La prolina (Pro) es un iminoácido importante en la respuesta de defensa de las plantas contra patógenos. El metabolismo de Pro tiene la particularidad de estar formado por enzimas que se localizan en diferentes compartimentos subcelulares. Las enzimas de producción de Pro (P5CR y P5CS) residen en el citosol, mientras que las enzimas de catálisis (ProDH y P5CDH) se localizan en las mitocondrias. Las dos vías pueden actuar acopladas reciclando intermediarios. En este caso, se trasloca poder reductor desde el citosol hacia las mitocondrias para alimentar la cadena de transporte de electrones. Una enzima clave en el metabolismo de la Pro es la prolina dehidrogenasa (ProDH), que cataliza la conversión de Pro a pirrolina-5-carboxilato (P5C) en la vía de degradación de este aminoácido. En Arabidopsis, la ProDH se codifica mediante dos genes, ProDH1 y ProDH2. Investigaciones previas de nuestro grupo han demostrado que ambos genes son necesarios para activar la resistencia contra varios patógenos, como Pseudomonas syringae pv. Tomato AvrRpm1, Pseudomonas syringae pv. Tomato DC3000 (patógenos hemibiotróficos avirulento y virulento, respectivamente), y Botrytis cinerea (patógeno necrótrofo virulento). La ausencia de ProDH en plantas silenciadas en ambos genes, así como en simples mutantes de cada isoforma, resulta en una reducción de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) apoplástico frente a la exposición a flg22 o la infección con patógenos. En base a ello, nos propusimos investigar el papel de la ProDH en la respuesta al estrés oxidativo, a fin de entender cómo esta enzima mitocondrial afecta la actividad de la RBOHD membrana plasmática (principal productora de ROS apoplásticos durante el estrés biótico). Para estudiar los cambios redox que ocurren in vivo en los tejidos de Arabidopsis, empleamos biosensores genéticamente codificados basados en proteínas fluorescentes capaces de cambiar sus propiedades de fluorescencia en función de su grado de oxidación/reducción. Utilizamos el GRX1-roGFP2 para determinar la relación GSSG/GSH y el biosensor NERNST para evaluar la relación NADP+/NADPH. Analizando el sensor GRX-roGFP2 citosólico exploramos el efecto de ProDH sobre la respuesta a H2O2 exógeno. Observamos que la ausencia de ambas isoformas de ProDH aumenta la oxidación del glutatión citosólico. Por el contrario, frente al tratamiento con flg22, tanto prodh1 como prodh2 mostraron una disminución del nivel oxidativo del glutatión citosólico en comparación con la planta control. Además, estudiamos el efecto de ProDH en la oxidación del citosol frente a la infección con Pst DC3000. Detectamos dos picos de oxidación en la cupla GSSG/GSH, siendo el segundo más intenso que el primero. Encontramos que tanto ProDH1 como ProDH2 son necesarias para evitar una oxidación exacerbada del citosol a tiempos tardíos de exposición al patógeno. Sabiendo que la RBOHD requiere de NADPH para su funcionamiento y que el metabolismo de Pro involucra a la cupla NADP+/NADPH en su vía de síntesis, quisimos evaluar si esta cupla redox constituye el nexo entre dicho metabolismo y la oxidasa de membrana. Por medio del biosensor NERNST, observamos que la ausencia de ProDH genera una disminución en la oxidación del NADPH citosólico durante el tratamiento con flg22 y Pst DC3000. Esto sugiere que ProDH podría modular la cupla NADP+/NADPH afectando así el funcionamiento de enzimas que requieren NADPH para su actividad, incluida la RBOHD. Al analizar qué sucede con el estado redox cloroplástico por medio del biosensor GRX1-roGFP, observamos que la falta de ProDH aumenta la reducción del glutatión en los cloroplastos en estado basal. Además, determinamos que las plantas mutantes prodh1 y prodh2 muestran una mayor susceptibilidad en sus cloroplastos a diferentes estreses oxidativos, como la exposición a H2O2 exógeno y al herbicida metil viológeno (MV). También analizamos el efecto de la infección por Pst DC3000 en el estado redox de los cloroplastos. Encontramos así que la ausencia de ProDH induce un mayor nivel de oxidación y que la falta de ProDH1 genera cambios más significativos en comparación con la falta de ProDH2. Sabiendo que in vitro ProDH1 y ProDH2 no cumplen funciones redundantes sino complementarias, quisimos evaluar si isoformas presentan diferencias en su actividad enzimática. Para ello expresamos y caracterizamos las versiones recombinantes de cada isoforma en Escherichia coli. Ambas enzimas recombinantes mostraron valores de Km par Pro similares entre sí. La eliminación de una porción del extremo N-terminal condujo a la inactivación de las mismas, demostrando la importancia de dicha región, la cual no contiene el sitio catalítico. Además, determinamos que ambas isoformas son capaces de formar complejos oligoméricos para los cuales es imprescindible la presencia del N-terminal completo. Los resultados del presente trabajo sugieren que ProDH desempeña un papel clave en la regulación del equilibrio redox de locaciones subcelulares diferentes a la de la enzima, y que su ausencia afecta la capacidad antioxidante y el funcionamiento de enzimas sensibles a cambios redox.

Proline (Pro) is an important imino acid in the plant defense response against pathogens. Pro metabolism involves enzymes located in different subcellular compartments. The anabolic enzymes (P5CR and P5CS) reside in the cytosol, while the catalytic enzymes (ProDH and P5CDH) are located in the mitochondria. Both pathways can act in coordination recycling intermediates. In this case, reducing power can be translocated from the cytosol to the mitochondria to fuel the electron transport chain. A key enzyme in Pro metabolism is Pro dehydrogenase (ProDH), which catalyzes the conversion of Pro to pyrroline-5-carboxylate (P5C). In Arabidopsis, ProDH is encoded by two genes, ProDH1 and ProDH2. Our group previously demonstrated that both genes are necessary to activate resistance against various pathogens, such as Pseudomonas syringae pv. tomato AvrRpm1, Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avirulent and virulent hemibiotrophic pathogens, respectively) and Botrytis cinerea (virulent necrotrophic pathogen). The absence of ProDH in plants silenced for both genes, as well as in single mutants of each isoform, results in a reduction of apoplastic reactive oxygen species (ROS) production upon exposure to flg22 or pathogen infection. Based on this, we aimed to investigate the role of ProDH in the response to oxidative stress, to understand how this mitochondrial enzyme affects the activity of plasma membrane-localized RBOHD, a main producer of apoplastic ROS during biotic stress. We used genetically encoded biosensors to study the in vivo redox changes in Arabidopsis tissues. These sensors are fluorescent proteins capable of changing their fluorescence properties based on their degree of oxidation/reduction. GRX1-roGFP2 allowed us to determine the GSSG/GSH ratio and the NERNST biosensor the NADP+/NADPH ratio. By analyzing the cytosolic GRX1-roGFP2 sensor, we explored the effect of ProDH on the response to exogenous H2O2. We observed that the absence of both ProDH isoforms increases the oxidation of cytosolic glutathione. On the contrary, prodh1 and prodh2 showed lower cytosolic glutathione oxidation compared to the control plant in response to flg22 treatment. Furthermore, we studied the effect of ProDH on cytosolic oxidation during infection with Pst DC3000. We detected two peaks of oxidation in the GSSG/GSH couple in wild type plants, with the second peak being stronger than the first one. Interestingly, ProDH1 and ProDH2 were necessary to prevent excessive cytosolic oxidation at later times of pathogen exposure. Considering that RBOHD requires NADPH, and that Pro metabolism involves the NADP+/NADPH couple in its synthesis pathway, we evaluated if this redox couple serves as the link between Pro metabolism and RBOHD activity. Analysis of the NERNST biosensor indicated that the absence of ProDH leads to a decrease in cytosolic NADPH oxidation during treatment with flg22 and Pst DC3000. This suggests that ProDH could modulate the NADP+/NADPH ratio, thereby affecting the functioning of NADPH-sensitive enzymes, including RBOHD. When analyzing the chloroplastic redox state using the GRX1-roGFP biosensor, we observed that the lack of ProDH increases glutathione reduction at this compartment under basal conditions. Additionally, we determined that prodh1 and prodh2 mutant plants show differences in chloroplastic responses to oxidative stresses, such as exposure to exogenous H2O2 or methyl viologen (MV). We also examined the effect of Pst DC3000 infection on the chloroplastic redox state. Consequently, we found that the absence of ProDH induces a higher level of oxidation, with ProDH1 deficiency causing more significant changes compared to absence of ProDH2. Knowing that ProDH1 and ProDH2 do not have redundant functions but rather complementary ones, we evaluated if these isoforms exhibit differences in enzymatic activity. To do this, we expressed recombinant protein versions isoform in Escherichia coli and characterized them. Both recombinant enzymes showed similar Km values for Pro. Removal of a portion of the N-terminal region, where the catalytic site is not present, led to their inactivation. Moreover, we determined that both isoforms are capable of forming oligomeric complexes, and this requires the presence of the complete N-terminal region. These results suggest that ProDH plays a key role in regulating the redox balance of different subcellular locations, and its absence affects the antioxidant capacity and functioning of enzymes sensitive to redox changes.