Caracterización de proteínas del citoesqueleto y análisis de su contribución a los mecanismos de morfogénesis, división celular y segregación de cromosomas en Streptococcus pneumoniae

Abstract

La división celular bacteriana debe ser regulada con precisión y coordinarse con otros procesos claves para el ciclo celular, tales como la elongación celular, la replicación del ADN y la segregación cromosómica, con el fin de garantizar que cada célula hija adquiera un tamaño adecuado y contenga un genoma completo. En la mayoría de las bacterias, el mecanismo de división celular lo inicia el homólogo de tubulina FtsZ, proteína que polimeriza en el medio de las células en división para formar un anillo filamentoso. Este anillo está unido a la membrana celular a través de FtsA, la cual forma protofilamentos similares a la actina y es necesaria para reclutar proteínas del divisoma bacteriano, complejo proteico que es responsable, entre otras funciones, de la biosíntesis de pared celular y de la división celular. Por otra parte, se ha demostrado en E. coli que la división celular necesita una adecuada relación de FtsZ/FtsA. En este trabajo demostramos que, en contraste con lo que sucede con FtsZ, ligeras variaciones en la expresión de FtsA inducen cambios morfológicos y defectos de crecimiento celular, lo que lleva a una forma y tamaño de células heterogéneas con una tasa de crecimiento celular disminuida. Usando la técnica GFP-Trap assay, realizamos además una co-purificación seguida de un análisis de LC-MS/MS para determinar el interactoma de FtsA. Curiosamente, encontramos un enriquecimiento de varias proteínas involucradas en la división celular y el metabolismo de la pared celular. El principal factor unido a FtsA fue PBP2x, una proteína de unión a penicilina implicada en la síntesis de peptidoglicano septal. Este hallazgo confirmaría el rol de FtsA en el cierre septal durante la división celular. En el análisis del interactoma de FtsA, se encontraron proteínas involucradas en el metabolismo y remodelado de la pared como MpgA, PBP1b, PBP1a y SPD_1620. Este resultado, en conjunto con la localización de FtsA en el polo distal confirmada en este estudio, sugiere que FtsA también participa en el mantenimiento de la pared celular posterior al evento de división. Analizamos también los mecanismos utilizados por la bacteria para contrarrestar el efecto lítico producido por desequilibrios en los niveles de FtsA. Se ha demostrado que el sistema de dos componentes CiarRH es importante para mantener la integridad celular por regular la respuesta a condiciones de estrés que inducen la lisis en S. pneumoniae, tales como antibióticos, mutaciones en PBP2x, deprivación de colina, etc. Este efecto protector implica la regulación de la expresión del gen lytA que codifica para LytA, la principal autolisina neumocócica. La autolisis inducida por la sobreexpresión de FtsA se suprime en la mutante ΔlytA, lo que indica la dependencia de la actividad de amidasa de LytA. La sobreexpresión de FtsA produjo susceptibilidad de la pared celular, evidenciada por una mayor captación de ioduro de propidio por parte de las células y el aumento de la sensibilidad a antibióticos líticos como la vancomicina. Estos defectos de la pared celular podrían ser la señal para la activación de LytA, y también para su contraparte, CiaRH. Además, la mutante ΔciaR (regulador de respuesta) presenta un fenotipo lítico agravado, lo que refuerza el papel protector de este sistema. En conjunto, estos resultados indican que FtsA es una proteína clave, no solo durante el ciclo celular temprano, sino también en la elongación bacteriana y en el cierre del septo en S. pneumoniae. Además, desbalances en los niveles de FtsA inducen lisis para lo cual la bacteria cuenta con un sistema protector. Además, en esta tesis se incluye como anexo actividades realizadas como parte de la respuesta que brindó el equipo de salud de nuestro instituto a la pandemia de COVID-19. Dicho trabajo consiste en el estudio a nivel molecular de las variantes de SARS-CoV-2 circulantes en la provincia de Córdoba durante la primera ola de la pandemia en septiembre de 2020. Si bien este trabajo no tiene una relación directa con el tema principal de la tesis, ha significado una formación doctoral invalorable para la tesista.