Estudios estructurales y bioquímicos de enzimas y reacciones de iniciación de la biosíntesis de proteoglucógeno

Abstract

En mamíferos la biosíntesis de novo de glucógeno comienza con la acción de una enzima llamada glucogenina, que es capaz de incorporar sobre sí misma, de manera autocatalítica, una molécula de glucosa, a través de la formación de un enlace Oglicosídico entre un residuo tirosina y el extremo reductor de la glucosa (a-1-0-Tyr). Además, puede catalizar un segundo proceso químicamente diferente, la incorporación sucesiva de glucosas mediante la formación de enlaces a-(1 -.4), formando así un oligoglucano lineal sobre el que actúan las enzimas glucógeno sintasa (GS) y ramificante (GBE) para dar lugar a una nueva molécula de proteoglucó geno. Aquí se presentan los resultados obtenidos a partir de estudios relacionados con la estructura y función de glucogenina y GBE, dos de los tres actores principales en la biosíntesis de novo del glucógeno. En particular, en este trabajo de tesis doctoral se profundizó en el conocimiento acerca del mecanismo por el cual la autoglucosilación de glucogenina genera el oligoglucano necesario para que se inicie la biosíntesis de novo del glucógeno. Hace unos años se había demostrado que el dímero de glucogenina tiene la capacidad de autoglucosilarse mediante un mecanismo de glucosilación intersubunidad, y nuestro lb grupo había aportado evidencias de que el monómero era capaz de autoglucosilarse, sugiriendo que el dímero podía glucosilarse por un mecanismo intrasubunidad. A través del diseño de experimentos que incluyeron la mezcla de mutantes de glucogenina inactivas para la catálisis o incapaces de funcionar como sustrato aceptor de glucosa, en este trabajo de tesis doctoral se pudo revelar que ambos mecanismos, intra- e intersubunidad, se complementan en el dímero para alcanzar el máximo grado de autoglucosilación. También se analizó la posibilidad de que el monómero de glucogenina sea capaz de generar un oligoglucano que pueda ser utilizado como sustrato por las enzimas GS y GBE para dar lugar a una nueva molécula de glucógeno madura. En el caso de la enzima ramificante del glucógeno es menor la cantidad de datos de que se dispone acerca de su mecanismo de acción, y muchos de los informes al respecto corresponden a enzimas de la familia de glicosil hidrolasas GH13, a la que pertenece GBE, tales como a-amilasas e isoamilasas. Los estudios bioquímicos y cinéticos de GBE publicados hasta el momento fueron realizados con enzimas de origen bacteriano, y algunos de origen vegetal para el caso de la enzima ramificante del almidón (SBE). En el segundo capítulo se presentan los primeros resultados de la caracterización de GBE humana, que incluyen el perfil de la longitud de las ramas que genera y un estudio cinético de la reacción que cataliza. Por último, se abordó un enfoque bioinformático para tratar de develar el interrogante acerca de cuál es la estructura que glucogenina debe adoptar para superar la distancia de 12-20 A que separa a la tirosina aceptora del UDP-glucosa, y así lograr la incorporación de la primera glucosa que da comienzo a la reacción de autoglucosilación. Para llevar a cabo esto se utilizaron simulaciones de dinámica molecular guiada, con lo que se consiguió obtener detalles a nivel atómico de las interacciones que podrían ser responsables para que el cambio conformacional tenga lugar.