Desarrollo de sistemas de expresión y purificación de proteínas recombinantes de interés industrial

Abstract

La expresión heteróloga de proteínas ha permitido la producción de las mismas a gran escala, lo que en la mayoría de los casos difícilmente se puede conseguir desde sus fuentes naturales. Este trabajo de Tesis tiene como objetivo contribuir en el campo de la biotecnología de proteínas recombinantes en tres aspectos particulares, los cuales se resumen a continuación. Por un lado, usamos a la hormona de crecimiento humana (hGH) como proteína modelo para desarrollar e implementar una nueva etiqueta de afinidad autoclivable. Como la hGH es de uso terapéutico, no puede poseer aminoácidos extras y debe comenzar con su aminoácido natural que es la fenilalanina (Phe). Para purificar una proteína recombinante se puede usar una etiqueta de afinidad, la cual permite purificar mediante cromatografía de afinidad, una proteína de interés fusionada a la misma. Las inteínas son elementos que se pueden fusionar entre una proteína de interés y una etiqueta de afinidad, permitiendo en un proceso de autoescisión, liberar a la proteína de interés sin dejarle ningún aminoácido extra. Mediante la expresión de la hGH recombinante (rhGH), desarrollamos e implementamos una nueva etiqueta de afinidad de autoescisión inducible por cambio de pH y temperatura, basada en la mini inteína Ssp DnaX. Esta etiqueta se fusionó en el C-terminal de la rhGH, y en el N-terminal de la misma se adicionó un péptido señal periplásmico. Bajo una condición de cultivo a pH 8 (que evita la autoescisión in vivo de la inteína), esta etiqueta de afinidad permitió la expresión y posterior purificación de la rhGH portando el aa Phe en el N-terminal. En conclusión, diseñamos e implementamos un nuevo sistema de expresión y purificación de proteínas recombinantes periplásmicas, en E. coli, mediante una etiqueta de afinidad autoclivable, basada en la inteína DnaX, destinado principalmente a proteínas que contienen puentes disulfuro. En segundo lugar, utilizamos a la L-lactato oxidasa (LOX) como proteína modelo, debido al interés en esta enzima que manifestaron dos empresas Nacionales (Wiener Laboratorios SAIC y NovoSens), para desarrollar un proceso biotecnológico para la producción de proteínas de uso industrial en E. coli, mediante un cultivo alimentado en un biorreactor. La LOX es una enzima biotecnológicamente importante que se utiliza en kits colorimétricos y biosensores para detectar lactato, un parámetro clave en el diagnóstico clínico, la medicina deportiva y la industria alimentaria. Mediante el uso de la LOX desarrollamos un proceso biotecnológico para la producción en E. coli de proteínas recombinantes de uso industrial en biorreactor. Produjimos la LOX de Aerococcus viridans recombinante fusionada a la etiqueta His-tag (rLOX). Mediante el análisis de esta proteína, pudimos demostrar que la enzima fusionada a la etiqueta de afinidad fue totalmente funcional tanto en un kit colorimétrico comercial para diagnóstico humano, como en un biosensor amperométrico para medir el ácido láctico en productos alimenticios, mostrando un rendimiento comparable al de las LOXs comerciales sin etiqueta de afinidad. Como el uso industrial de la enzima LOX requiere una producción a gran escala, desarrollamos un proceso de cultivo alimentado en biorreactor y obtuvimos un rendimiento aproximadamente diez veces mayor que el obtenido en Erlenmeyer. La etiqueta de afinidad nos permitió un proceso de purificación fácil y altamente eficiente, y se recuperó una rLOX de alta pureza, después de un solo paso de purificación por cromatografía de afinidad. Este es un proceso simple, rápido y económico para la producción de la enzima LOX recombinante para uso industrial. Finalmente, utilizamos la proteína terapéutica humana alfa-galactosidasa A (GLA) como proteína modelo para el desarrollo de sistemas productivos en células de mamíferos en cultivo y para la búsqueda de mutantes de dicha enzima con propiedades terapéuticas mejoradas. La GLA se utiliza en la terapia de reemplazo enzimático (ERT, por sus siglas en inglés) para el tratamiento de pacientes con la enfermedad de Fabry. A diferencia de las otras dos proteínas modelos que utilizamos, la GLA es una glicoproteína, por lo que para su expresión fue necesario utilizar células de mamíferos en cultivo (CHO y HEK). Logramos la expresión de la GLA recombinante en forma activa, tanto en células CHO adheridas como en células HEK en suspensión. Con el objeto de contribuir no sólo en el aspecto productivo de esta enzima, sino también en un desarrollo innovador, nos planteamos la búsqueda de mutantes de la GLA más activas como potenciales proteínas terapéuticas mejoradas. Expresamos y comenzamos a caracterizar un grupo de mutantes de la GLA descriptas en la literatura como potencialmente más activas y algunas combinaciones de las mismas. Si bien los resultados en este tema son preliminares, dentro de las mutantes analizadas, aquellas conteniendo deleciones en el extremo C-terminal (Δ7 y Δ10) y la mutante puntual R252T, serían más activas y estables en solución que la GLA salvaje. Estas mutantes podrían superar algunas complicaciones asociadas con la ERT actual, ya que los tratamientos con dosis más bajas de estos mutantes podrían lograr un efecto terapéutico similar o superior al del enzima de tipo salvaje.