Efecto de NO2-OA sobre el estrés oxidativo, gliosis, neovascularización y neurodegeneración retinal en modelos experimentales in vitro e in vivo: Participación de la Célula Glial de Müller

Abstract

Resumen: Diversas patologías retinianas convergen en la neovascularización (NV) patológica debido al crecimiento anormal de vasos. Entre ellas, las de mayor incidencia mundial que conducen a pérdida de visión y ceguera irreversible son la Retinopatía Diabética (RD) y la Retinopatía del Prematuro (ROP, por Retinopathy of Prematurity). Durante años los principales estudios clínicos y básicos, estuvieron dirigidos sólo a identificar los mecanismos de la enfermedad vascular. Sin embargo, hoy se conoce que células no vasculares como glía y neuronas también se ven afectadas. En este sentido, numerosas evidencias han demostrado que una función visual anormal, así como una sensibilidad disminuida al contraste preceden a los signos clínicos microvasculares detectables de la patología. Entre los mecanismos etiopatogénicos de las retinopatías proliferativas (RP) convergen componentes inflamatorios, daño oxidativo, y aumento en la producción de especies reactivas del nitrógeno (ERN), entre otros. En este sentido, niveles elevados de especies reactivas del oxígeno (ERO) causan citotoxicidad o apoptosis, pero también actúan como segundos mensajeros regulando a nivel retinal, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, por vascular endothelial growth factor). Debido a ello, varios estudios han sido realizados con el fin de reducir el exceso de ERO en las retinopatías. Sin embargo, una estrategia menos explorada en retina es la modulación de mediadores celulares involucrados en la defensa antioxidante, como el sistema Keap1-Nrf2, que regula la expresión de enzimas antioxidantes de fase II tales como hemo-oxigenasa-1 (HO-1), NAD(P)H quinona oxidorreductasa 1 (NQO1), así como enzimas implicadas en la biosíntesis de glutatión, entre otras. En los últimos años, numerosos trabajos han demostrado el efecto antiinflamatorio y citoprotector de los ácidos grasos-nitrados (NO2-FA, por Nitro-Fatty acids) representados principalmente por el ácido nitro-oleico (NO2-OA, por Nitro-oleic acids), nitro-linoleico (NO2-LA, Nitro-linoleic acids) y el nitro-linoleico conjugado (NO2-CLA, Nitro-conjugated linoleic acids). Por lo que el objetivo de este trabajo de tesis fue investigar el efecto de los NO2-FA sobre eventos de NV, gliosis, aumento de citoquinas proinflamatorias y estrés oxidativo presentes en las RP. Para este fin, recurrimos a dos modelos experimentales de estudio in vitro e in vivo. En el primero, utilizamos principalmente células gliales de Müller (CGM) debido a que participan en procesos de inflamación, gliosis, síntesis y secreción de factores tróficos (como VEGF) y antioxidantes en la retina. Nuestros resultados mostraron que el tratamiento con el NO2-OA indujo la expresión proteica y transcripcional de la proteína HO-1 mediante la activación de la vía antioxidante Keap1-Nrf2. Además, previno el incremento de los niveles de ERO inducidos por el estímulo de lipopolisacáridos (LPS), forbol 12-miristato 13-acetato (PMA, por Phorbol 12-myristate 13-acetate) y la proteína extracelular α-2 Macroglobulina (α2M). Interesantemente, esta proteína presente en niveles elevados en las retinopatías también induce gliosis reactiva la cual fue prevenida por el tratamiento con el NO2-OA. Además, cuando analizamos la respuesta proangiogénica en CGM bajo estímulo hipóxico y proinflamatorio, se observó que el NO2-OA redujo significativamente los niveles de ARNm de VEGF-A. En línea con estos resultados también demostramos que el NO2-OA inhibió la formación de túbulos y el pretratamiento con un inhibidor efectivo de Nrf2, anuló este efecto. En función de los resultados obtenidos in vitro decidimos indagar en un modelo de retinopatía experimental inducida por oxígeno (OIR, por Oxygen-Induced Retinopathy) en ratones, el efecto del NO2-OA en los procesos vasoproliferativos y neurodegenerativos retinales, así como su mecanismo de acción. Cabe aclarar que el modelo de OIR constituye una poderosa herramienta para elucidar los mecanismos involucrados en las RP y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas. Es así que, en nuestro laboratorio, previamente demostramos en el modelo de OIR que además de la vaso-obliteración (VO) y NV retinal se observa daño neuronal, activación glial y pérdida funcional de la retina acompañadas de un incremento en el flujo autofágico. Los resultados obtenidos en este trabajo de tesis mostraron que la administración por vía intraocular (i.o.) de NO2-OA, fue capaz de inducir la angiogénesis reparativa, disminuyendo el área avascular central y la NV patológica. Interesantemente, también evitó la gliosis al atenuar los niveles de GFAP, pero no fue capaz de revertir la disminución de la enzima detoxificante de glutamato, GS. Además, evitó el daño en la funcionalidad retinal reflejado en la capacidad de mantener la amplitud, así como también el tiempo de latencia de la onda-b (retina interna) a P26 OIR. En línea con estos resultados, también se observó que el NO2-OA previno la disminución de la expresión de caspasa-3 total a P26 OIR. Dado que, en la actualidad, los tratamientos disponibles para las retinopatías (fotocoagulación, vitrectomía, inyección intraocular de anticuerpos monoclonales) intentan enlentecer la progresión, pero solo en casos muy puntuales logran mejorarla, los hallazgos obtenidos en este trabajo de tesis sugieren la utilización del NO2-OA como una posible estrategia terapéutica en enfermedades invalidantes como las RP, debido a que induce angiogénesis reparativa, evita la gliosis e impide la perdida de funcionalidad retinal, así como de daño neuronal.

Abstract: Pathological retinal neovascularization (NV) is a leading cause of serious vision loss in potentially blinding eye diseases such as proliferative diabetic retinopathy (PDR) and retinopathy of prematurity (ROP). Accumulating evidences, stemming from experimental models and clinical studies of proliferative retinopathies (PR) have provided insights into the mechanisms of vascular injury. However, it is known that non-vascular cells such as glia and neurons are also affected, with the consequent production of gliosis (increased GFAP levels) and neurodegeneration (retinal functional loss, altered neurotrophic balance and neuronal damage). In this sense, numerous evidences have shown that an abnormal visual function, as well as a decreased sensitivity to contrast, precede the detectable microvascular clinical signs in PR. Among the etiopathogenic mechanisms converge inflammatory components, oxidative damage, and increased production of reactive nitrogen species (RNS). In this sense, high levels of reactive oxygen species (ROS) cause cytotoxicity or apoptosis, but they also act as second messengers regulating retinal VEGF levels. In fact, several studies have been carried out in order to reduce the excess of ROS in retinopathies. However, an unexplored therapeutic strategy in retina is the modulation of transcription factors involved in antioxidant defense, such as the Keap1-Nrf2 system, which regulates the expression of phase II antioxidant enzymes such as heme oxygenase-1 (HO-1), NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 (NQO1), as well as enzymes involved in glutathione biosynthesis, among others. Recently, numerous studies have demonstrated the anti-inflammatory and cytoprotective effect of nitro-fatty acids (NO2-FA) including nitro-oleic acid (NO2-OA), nitro-linoleic acid (NO2-LA) and conjugated nitro-linolenic acid (NO2-CLA). Therefore, the objective of this work was to investigate the effect of NO2-FA on NV, gliosis, inflammation and oxidative stress in PR. For this purpose, we used two experimental models in vitro and in vivo. In the first one, Müller glial cells (MGCs) were selected due to the crucial role that play in diabetic retinas. Our results showed that treatment with NO2-OA induced protein and transcriptional expression of HO-1 by activating the Keap1-Nrf2 antioxidant pathway. In addition, NO2-OA treatment prevented the increase of ROS levels induced by LPS, PMA and the extracellular protein α2M. Interestingly, this protein, present at elevated levels in PR, also induced reactive gliosis, which was prevented by NO2-OA treatment. Furthermore, when we analyzed the pro-angiogenic response in MGCs under hypoxic and pro-inflammatory stimuli, NO2-OA significantly reduced VEGF-A mRNA levels. In line with these results, we also show that NO2-OA inhibited tube formation and pretreatment with an Nrf2 inhibitor, abolished this effect. In order to deepen our in vitro results, we have investigated the effect of NO2-OA on retinal vasoproliferative and neurodegenerative processes in an experimental oxygen-induced retinopathy (OIR) mice model. It should be noted that the OIR model is a powerful tool for elucidating the mechanisms involved in PR and developing new therapeutic strategies. Previously, we demonstrated in the OIR model retinal vaso-obliteration (VO) and NV, neuronal damage, glial activation and retinal functional loss, accompanied by an increase in autophagic flux. Here, the results showed that an intraocular (i.o.) NO2-OA injection at P12 OIR, was able to induce reparative angiogenesis, decreasing the VO and pathological NV. Interestingly, it also prevented gliosis attenuating GFAP levels, but was unable to reverse the levels of the glutamate detoxifying enzyme, GS. Additionally, NO2-OA treatment prevented the reduction in amplitude, as well as the increase in latency of the b-wave (inner retina) at P26 OIR. In line with these results, NO2-OA was also found to prevent the decrease levels of total caspase-3 at P26 OIR. Considering the limitations and the side effects of current treatments of PR (photocoagulation, vitrectomy, intraocular injection of monoclonal antibodies) the results of this work underscore the role of NO2-OA as a novel therapeutic agent that attenuate neovascular and neurodegenerative processes.