Los linfocitos B y las células plasmáticas regulan la respuesta inflamatoria en la infección con Trypanosoma cruzi

Abstract

La enfermedad de Chagas, causada por el parásito Trypanosoma cruz¡, afecta a 8 millones de personas e impone una importante carga económica debido a la mortalidad temprana y discapacidad fisica. Es endémica en América Latina, pero se convirtió en un problema de salud pública mundial por la migración de las personas infectadas. La progresión de la enfermedad, desde asintomática a grave, está vinculada a la heterogeneidad de las distintas cepas del parásito existentes y a una variable respuesta inmune del hospedador infectado. Se ha informado que la persistencia del parásito, así como la intensidad de la respuesta inflamatoria son determinantes de las manifestaciones clínicas de la enfermedad [1, 21. A pesar de que la inflamación es indispensable para la defensa del huésped [3-14], cuando está desregulada puede contribuir a lesiones tisulares y disfunción orgánica [15-19]. En consecuencia, la identificación de la naturaleza de las células y moléculas capaces de mantener la integridad del hospedador, así como la replicación del patógeno, es crucial para la comprensión de la patogénesis de la enfermedad de Chagas y también para el diseño de nuevos enfoques terapéuticos. La fase aguda de la enfermedad de Chagas en ratones y seres humanos se caracteriza por un estado de inmunosupresión en el que T. cruz¡ se replica extensivamente e induce moléculas inmunomoduladoras que retrasan las respuestas de linfocitos (Li) T específicos del parásito. Este estado de las células T coexiste con la activación policlonal de LiB, lo que sugiere que los LiB pueden influir en la función de LiT y viceversa. Durante la infección por T cruz¡, se ha establecido que los LiB tienen un rol protector fundamental [20], y se ha descripto que los anticuerpos (Acs), los cuales son producto de estas células, pueden ejercer funciones tanto protectoras [21-23] como deletéreas (Acs autoreactivos) [24, 251]. Sin embargo, no se han descripto en profundidad mecanismos ejercidos por los LiB independientes de su capacidad para producir Acs. Últimamente, en diversos modelos experimentales, se han reportado funciones regulatorias tanto para los LiB [26] como para LiB que expresan CD138 y que corresponden a estadios de diferenciación, denominados plasmoblastos y/o células plasmáticas (PL/CP), siendo las células plasmáticas (CF) el estadio de diferenciación terminal [27-30]. La mayoría de los mecanismos regulatorios, ejercidos por las células mencionadas, involucran la secreción de citoquinas [28-31]. Sin embargo, queda por esclarecer el posible papel regulador desempeñado por los LiB y los PL/CP vía moléculas inhibitorias expresadas en la superficie celular. Es por ello que el objetivo de este trabajo de tesis fue: Evaluar la función regulatoria de los LiB y de su producto de diferenciación, los PL/CP, sobre la respuesta 1q inflamatoria disparada en la infección con T. cruz¡ y tratar de identificar alguno de los mediadores involucrados. Para ello, utilizamos un modelo de infección en ratones ya descripto y en curso en nuestro laboratorio, que consiste en la infección de ratones C57BL/6 (controles, del Inglés: WT) con tripomastigotes del T cruzi cepa Y-br. Para llevar a cabo nuestro objetivo empleamos además ratones muMT, los cuales son ratones modificados genéticamente deficientes en LiB maduros. Observamos que los ratones muMT infectados presentan una prematura mortalidad pero son capaces de controlar la replicación del T. cruz¡. Los ratones muMT infectados presentaron un aumento significativo en la concentración plasmática de IFN-y y TNF, en comparación a ratones WT infectados; sugiriendo que en ausencia de LiB la infección dispara una exacerbada respuesta inmune pro-inflamatoria. En particular, los ratones muMT infectados presentaron alteraciones clínicas y bioquímicas asociadas a elevados niveles de TNF en suero, y una correlación entre la concentración de TNF y su mortalidad. El bloqueo de TNF promovió una recuperación inicial en el peso corporal de los ratones muMT infectados tratados, pero a tiempos tardíos los ratones murieron por exacerbación de la respuesta pro-inflamatoria. En correlación con los incrementados valores de TNF en plasma, los ratones muMT infectados presentaron un mayor porcentaje y número relativo de células productoras de TNF en bazo y ganglios linfáticos. En particular, la composición de la población secretora de TNF de los ratones muMT infectados con respecto a ratones WT infectados fue diferente; contenía un mayor porcentaje de LiT CD4*Ly6C+, LiT CD8Ly6C y de células con fenotipo de neutrófilo Ly6GLy6C. A su vez, siendo los LiT CD4 la mayoría de las células productoras de TNF en ambas cepas de ratones, los LiT CD4 de ratones muMT infectados presentaron un perfil pro-inflamatorio más exacerbado que sus análogos en ratones WT infectados, y la transferencia de LiT CD4 de ratones muMT infectados a ratones WT infectados alteró el perfil de los LiT CD4 en los ratones receptores y aumentó la secreción de IFN-y sistémico. Debido a que las alteraciones presentes en los ratones muMT infectados se producen en ausencia de los LiB, evaluamos los cambios fenotípicos y funcionales que sufre esta población celular durante la infección en los ratones WT, para así poder identificar a las poblaciones regulatorias B. Observamos que los Li B sufrieron una expansión inicial y posterior contracción tanto en bazo como en ganglios linfáticos, y que se generaron LiB de centro geiiiiinal (CG) y CF. Evaluando posibles mediadores regulatorios, observamos que durante la infección con T. cruz¡ los LiB y CP produjeron las citoquinas ILlO, TGF!3 e 1L6 y expresaron significativamente el Ligando 1 para el receptor PD1 (PDL1). Por medio de ensayos de eliminación de LiB y PL/CP, dentro de las células esplénicas de ratones infectados, evidenciamos que los LiB son capaces de regular negativamente, in vitro, a células secretantes de TNF a través de un mecanismo dependiente de contacto celular y que dicha función se abolió con el bloqueo de PDL1. Con el mismo tipo de ensayos evidenciamos que los PL/CP generadas durante la infección también son capaces de regular negativamente a células secretantes de TNF e IFN-y in vitro presentes en esplenocitos de ratones WT infectados. Al caracterizar en mayor profundidad a las CP de los ratones infectados con T. cruz¡, determinamos que las CP se ubican en focos extrafoliculares (EF), expresan CD11 c, PDL1 y otros receptores asociados a funciones supresoras como PDL2 y CD39. Demostramos que PDL1 se induce en los LiB a través de estímulos como ligandos de Toli, tripomastigotes de T cruz¡ e IFNy, y que CP generadas in vitro, al igual a lo determinado in vivo, presentaron mayor expresión de PDL1 que LiB activados. En base a este dato decidimos expandir, in vitro, a los LiB PDL1 para poder evaluar la función supresora de éstas células. Contrariamente a lo esperado, observamos que LiB activados con ligandos de TLR, o parásitos e IFNy o combinaciones de ellos y que expresan PDL1 indujeron la secreción de TNF y de IFNy por células esplénicas sin LiB (NoB) de ratones infectados. En estas condiciones experimentales los LiB parecían tener más una función presentadora de antígenos (Ag) que una función regulatoria. Para poder comprender este último resultado evaluamos el perfil fenotípico de los LiB y de las CP de los ratones infectados con T. cruz¡ y los comparamos con el perfil de los LiB activados in vitro con los estímulos arriba mencionados. Observamos que las CP de los ratones infectados con T. cruz¡ expresaron menos niveles de CD80 y MHCII, y mayores niveles de PDL1 y CD39 que LiB estimulados in vitro. Los resultados indican que los LiB y CP de los ratones infectados que ejercen una función regulatoria tienen un fenotipo particular que no es expresado por sus equivalentes obtenidos in vitro y que el solo aumento de la expresión de PDL1 en LiB o CP no garantiza una función regulatoria. En conclusión general, en la presente tesis doctoral, determinamos que las CP generadas en la infección con T cruzi son capaces de ejercer funciones adicionales a las de secretar Acs, como es la de ejercer una función regulatoria de células secretantes de TNF e IFN'y, a través de la expresión de PDL1.