Efecto del tratamiento con diazepam durante la inducción de las alteraciones neuropatológicas en la encefalomielitis autoinmune experimental

Abstract

Las bz son Clásicamente conocidas como tranquilizantes menores, son drogas que poseen propiedades farmacológicas de ansiolíticos, hipnóticos, miorelajantes de acción central, anticonvulsivantes e inducen sedación. Esta acción es mediada por el receptor central de benzodiacepinas (CBR), también conocido como receptor GABAA (Ácido y-aminobutírico) de localización principalmente neuronal. Las benzodiacepinas, cuentan también con un sitio de unión alternativo, conocido como receptor periférico de benzodiacepinas (PBR), o proteína translocadora de 18 kDa (TSPO). Su expresión es abundante en órganos endocrinos, piel, corazón, hígado, y en sistema nervioso central (SNC) se encuentra asociado con células de la microglía. TSPO también se encuentra presente en células inmunes y la acción de benzodiacepinas sobre TSPO ha sido asociada a algunas propiedades inmunomodulatorias sobre funciones del sistema inmune. La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal que reproduce muchas de las características clínicas, patológicas e inmunológicas de la enfermedad humana esclerosis múltiple (EM). Tanto la enfermedad humana como el modelo experimental se caracterizan por una respuesta inmune contra antígenos del SNC llevando a una patología inflamatoria. Se desencadena por la activación periférica de células T luego de entrar en contacto con células dendríticas (CD5). Consecuentemente, estos linfocitos se activan, proliferan, producen mediadores inflamatorios, y aumentan la expresión de adhesinas e integrinas que permiten acceder al SNC. Allí, son reactivados por células presentadoras de antígenos locales o que llegan desde periferia, favoreciendo el reclutamiento de otros leucocitos, entre ellos macrófagos (M4s), que exacerban la inflamación, favorecen la degeneración de oligodendrocitos, destrucción de la mielina y daño axonal. En este trabajo demostramos que animales desafiados para la EAE que fueron tratados con diazepam (Dz), presentaron una menor incidencia de la patología, parámetros clínicos atenuados, y una reacción de hipersensibilidad de tipo retardada (DTH) contra la PBM (proteína básica de mielina) disminuida. Luego caracterizamos la respuesta inmunológica durante la etapa aguda de la patología. En periferia (ganglios poplíteos), no se detectaron grandes cambios en cuanto al número de células aisladas y a la distribución de las poblaciones celulares mayoritarias entre los grupos experimentales. Sin embargo, en SNC de animales EAE tratados con Dz que no presentaron signos clínicos, se aislaron menos células infiltrantes y tanto las poblaciones de M4s, microglía activada así como también la población de linfocitos T CD4 infiltrantes productores de lEN-y e IL-17 resultaron disminuidas con respecto a los animales EAE tratados con vehículo. Posteriormente, evaluamos el efecto directo de esta droga sobre diferentes poblaciones celulares que participan activamente durante la inducción y desarrollo de la patología. En cultivos de linfocitos T, principales responsables del desarrollo de la patología, no se observó un efecto tóxico ni pro-apoptótico del Dz; sin embargo, la adición de esta droga redujo la proliferación y producción de citocinas proinflamatorias. En CDs, población importante para la iniciación de respuestas específicas de antígeno, el Dz no afectó la viabilidad. Sin embargo, cuando las CDs fueron estimuladas con LPS en presencia de Dz, se observó una reducción en las moléculas involucradas en la presentación antigénica, en la producción de citocinas pro-inflamatorias tales como IL-12, IL-6 y TNF-a y un aumento en los niveles de la citocina anti-inflamatoria IL-lO. Por otra parte, M4s tratados con Dz presentaron menor secreción de citocinas pro-inflamatorias, menores niveles de expresión de la enzima óxido nítrico sintasa inducible (¡NOS) y niveles elevados de las citocinas antiinflamatorias, IL-10 y TGF-, indicando que esta droga lleva a los M4s a adquirir un fenotipo de activación alternativo (M2). Por último, nos enfocamos en identificar el receptor responsable de los efectos ejercidos por el Dz en linfocitos T CD4+. Nuestros resultados indican que solo un porcentaje bajo de estas células expresa la subunidad y2 del receptor GABAA; sin embargo presentan una expresión generalizada de TSPO. Esto lleva a pensar que los efectos inducidos por Dz en esta población celular serian mediados por el receptor TSPO. Es importante mencionar que el mismo se encuentra presente en células de la microglía en pacientes con EM, como en animales con EAE y que cambios en sus niveles de expresión permiten emplearlo como un buen marcador molecular de neuroinflamación en nuestro modelo experimental. En conclusión podemos decir que Dz actúa como una potente droga inmunosupresora tanto in vivo sobre el desarrollo de la EAE como in vitro sobre células involucradas durante la evolución de la patología, siendo una herramienta importante para modular funciones del sistema inmune en enfermedades inflamatorias.