Rol de la proteína transportadora de lípidos StarD7 en la morfología, dinámica y función mitocondrial

Abstract

Resumen: Las mitocondrias son organelas esenciales para la supervivencia de las células eucariotas, ya que ejercen múltiples funciones bioquímicas, incluida la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa (OXPHOS), la síntesis de aminoácidos, grupo hemo, lípidos y la biogénesis de los grupos de hierro y azufre. Experimentan cambios dinámicos en tamaño, forma, número y distribución dependiendo de estímulos fisiológicos y patológicos. Estos cambios adaptativos ocurren a través de ciclos coordinados de fisión y fusión de mitocondrias. Las proteínas mitofusina 1 (Mfn1) y 2 (Mfn2) localizadas en la membrana mitocondrial externa (MME) y la proteína Optic atrophy 1 (OPA1) que se encuentra en la membrana mitocondrial interna (MMI) forman parte de la maquinaria de fusión. Por otro lado, la proteína citosólica Dynamin-related 1 (Drp1) media los eventos de fisión mitocondrial. La composición lipídica de las membranas mitocondriales es fundamental para preservar la actividad y estabilidad de los complejos proteicos implicados en la función, distribución y biogénesis de esta organela. Las mitocondrias sintetizan varios lípidos como fosfatidilglicerol, cardiolipina, fosfatidiletanolamina y ácido fosfatídico; mientras que otros como fosfatidilcolina (PC), fosfatidilserina, fosfatidilinositol, esteroles y esfingolípidos, deben importarse de otras organelas, principalmente desde el retículo endoplásmico (RE). StarD7, implicada en el transporte de PC a la mitocondria, se sintetiza como una proteína precursora (StarD7.I) que contiene una señal de localización mitocondrial la cual se escinde en la mitocondria originando la isoforma madura StarD7.II, que se libera al citoplasma o permanece en el espacio intermembrana mitocondrial (EIM). En estudios previos se demostró que el knockdown de StarD7 induce alteraciones en las mitocondrias y el RE con una reducción en el contenido de PC; sin embargo, se desconoce si StarD7 modula la dinámica y función mitocondrial. En este trabajo de tesis se analizó la participación de StarD7 en la morfología, dinámica y función mitocondrial utilizando dos modelos celulares: la línea HTR-8/SVneo derivada de trofoblasto humano de primer trimestre y la línea de mioblastos C2C12 derivada de tejido muscular de ratón. Se generaron células HTR-8/SVneo y C2C12 que sobre-expresan establemente las isoformas StarD7.I (D7.I) y StarD7.II (D7.II). Además ambas líneas celulares se silenciaron en forma transiente (siD7) y estable (shD7). Se demostró en la línea HTR-8/SVneo que la sobre-expresión de D7.I altera la morfología mitocondrial aumentando su fragmentación, mientras que no se observaron cambios en las células que sobre-expresan D7.II en comparación con las células estables control (Ct). Las células D7.I estables transportan mayor cantidad de PC a las mitocondrias que las células Ct, producen fusiones mitocondriales, mantienen el potencial de membrana y generan niveles más bajos de especies reactivas de oxígeno (ERO). Además, expresan mayor nivel de las proteínas Drp1 y Mfn2, con menor cantidad de Mfn1. Por otro lado, las células D7.I transfectadas con plásmidos que codifican a las mutantes Drp1-K38A, Drp1-S637D o Drp1-S637A indican que el fenotipo mitocondrial observado es dependiente de la actividad GTPasa de Drp1 y del grado de fosforilación de la serina 637. En contraste, el silenciamiento de StarD7 en la línea celular HTR-8/SVneo disminuye la expresión de las proteínas de fusión Mfn1 y Mfn2 sin modificar la cantidad de Drp1. Además, se observó que estas células aumentan los niveles de ERO y presentan mitocondrias fragmentadas en forma de “donut”, indicativas de estrés metabólico (Rojas et al., 2021) En la línea C2C12, se demostró que cambios en los niveles de StarD7 no modifican la morfología mitocondrial, evidenciada mediante tinción con MitoTracker Deep Red. Tampoco alteran la expresión de las proteínas de fisión/fusión Mfn1, Mfn2, Drp1, ni la expresión de PCG1α implicada en la biogénesis mitocondrial. Sin embargo, las observaciones realizadas por microscopía electrónica muestran, en las células shD7, una significativa desorganización en sus crestas mitocondriales con menor expresión de L-OPA1, proteína involucrada en su remodelación y mantenimiento. Finalmente, se demostró que el silenciamiento de StarD7 en las células C2C12, disminuye el potencial de membrana, impide la diferenciación celular a miotubos, mientras que incrementa el ECAR (extracellular acidification rate), la captación de glucosa y la acumulación de lípidos neutros. En conjunto, estos hallazgos proporcionan evidencia novedosa que indica que las alteraciones en la expresión de StarD7 producen cambios significativos en la morfología, dinámica y función mitocondrial dependiente del contexto celular.