Estudio sobre los mecanismos de acilación y transporte intracelular de proteínas periféricas aciladas

Abstract

La unión covalente de palmitato, u otros ácidos grasos, a residuos de cisteína a través de enlaces tioéster (S-acilación), es una modificación postraduccional reversible que tiene diferentes consecuencias sobre la proteína modificada. Dicha lipiclación está catli7ada por las enzimas acil-transferasas o PATs (del inglés Protein Afy1tran.'ferases), mientras que la deacilación involucra la actividad de las enzimas tioesterasas o APTs (del inglés 4y1-Protein Thioesterases). La manipulación farmacológica de esta modificación ha avanzado en los últimos tiempos gracias al desarrollo de diversos inhibidores principalmente de la deacilación, aunque también de la acilación. La utilización de los mismos permite un mayor entendimiento del proceso mediante el cual ocurre la palmitoilación y la importancia de su dinamismo y reversibilidad. Entre ellos el 2-bromopalmitato (2-BP), un análogo no metabolizable del ácido palmítico, es el más ampliamente utilizado para inhibir las PATs. Sin embargo, observaciones previas de nuestro laboratorio sugirieron que 2-BP podría afectar también el proceso de deacilación. En este trabajo investigamos el efecto de dicho compuesto, tanto in vivo como in ttiv, sobre la deacilación de la proteína GAP-43 y, más específicamente, sobre la actividad de APTI y APT2. En base a los resultados aquí presentados, y como la actividad enzimática de las APTs se vio inhibida por el tratamiento con 2-BP afectando los cielos de acilación/deacilación de la proteína estudiada, sugerimos que los análisis cinéticos y la interpretación de los resultados obtenidos mediante el uso de este inhibidor, deberían ser cuidadosamente revisados. Sin embargo, condiciones experimentales controladas utilizando 2-BP, pueden resultar útiles para detener el recambio de palmitato en proteínas palmitoiladas. Esto podría permitir el estudio de la importancia del proceso de deacilación en la función de dichas proteínas. Por otra parte, estudiamos el rol de la deacilación y de las tioesterasas sobre la localización intracelular dinámica de la proteína H-Ras, ya que la correcta distribución de dicha proteína es un aspecto fundamental en la biología de la misma. De esta manera, describimos los distintos procesos y la cinética mediante los cuales H-Ras es movilizada entre las diferentes organelas, y la interconexión existente entre ellas. A pesar de que se observaron notorias diferencias en cuanto a la localización subcelular de las variantes di y monoaciladas, demostrando la importancia de la estequiometria y la posición de los palmitatos, todas resultaron funcionales siendo capaces de activar la vía de señalización de Erkl /2. Además, demostramos que la deacilación de H-Ras monoadiladas se ve incrementada en células que sobreexpresan tanto APTI como APT2, modificando su localización subcelular. La versión salvaje, sin embargo, no mostró modificaciones en la escala de tiempo analizada, probablemente debido a un proceso de deacilación más lento. Por último, demostramos que tanto mecanismos de transporte vesicular como de difusión, están involucrados en el tráfico retrógrado de H-Ras desde membrana plasmática, realizando un aporte a los modelos establecidos previamente para el transporte intracelular de esta proteína. En conclusión, este trabajo destaca la importancia de la modificación por S-adilación y su dinámica sobre distintos aspectos estudiados en dos proteínas periféricas modelo (GAP- 43 y H-Ras). La modulación de la actividad de las enzimas involucradas en la palmitoilación (en este caso en particular, las tioesterasas) resulta relevante para determinar la dinámica del tráfico intracelular y la localización subcelular apropiada, pudiendo afectar, en consecuencia, la función de las proteínas modificadas.