Estudios funcionales relacionados a la proteína transportadora de lípidos StarD7 : efecto de la deficiencia de StarD7 sobre la expresión y función de conexina 43

Abstract

Resumen: La proteína transportadora de lípidos StarD7 pertenece a la superfamilia de proteínas con dominio START. La expresión evolutivamente conservada de estas proteínas en distintas especies resalta su importancia en el transporte, metabolismo y señalamiento intracelular lipídico. Está ampliamente demostrada la contribución de StarD7 en el mantenimiento de la homeostasis celular, participando en el transporte de fosfatidilcolina (PC) a la mitocondria, esencial para preservar la morfología y función mitocondrial. Además, el déficit de StarD7 se ha asociado a estrés de retículo endosplásmico y alteraciones en la proliferación y migración celular. En este trabajo de tesis se analizó la contribución de StarD7 sobre la expresión de conexina 43 (Cx43) y su participación en la migración celular polarizada usando como modelo de estudio la línea celular derivada de trofoblasto extravelloso HTR-8/SVneo, la cual exhibe un marcado fenotipo migratorio e invasivo. Se demostró que el silenciamiento de StarD7 conduce a una disminución del ARNm de Cx43 que se correlaciona con niveles disminuidos de su proteína. La disminución en los niveles de la proteína Cx43 se asoció a un aumento en los niveles de los transcriptos ITGA1, ITGA5, ITGB1 y NID1 así como en los niveles proteicos de integrina α1, integrina α5, integrina β1 madura, β-catenina y nidogen-1 y en la actividad de MMP9. Por otro lado, se demostró que el silenciamiento de StarD7 conduce a una disminución en la migración polarizada de las células HTR-8/SVneo con una reducción en los niveles proteicos de Twist1. Además, se detectó que las células con StarD7 silenciado tienen menor afinidad de adhesión sobre una superficie de fibronectina. Se estableció mediante ensayos de inmunofluorescencia que el silenciamiento de StarD7 conduce a una disrupción del aparato de Golgi y alteración en la localización del centro organizador de microtúbulos (MTOC) durante la migración polarizada. Mediante ensayos de recuperación se determinó que los niveles de Cx43 son dependientes de los niveles de expresión de StarD7. La recuperación de Cx43 en las células silenciadas contra StarD7 sugiere que los niveles de nidogen-1 son dependientes de la abundancia de la proteína Cx43 y que su recuperación permitiría restablecer la migración celular polarizada. En resumen, los hallazgos de este trabajo de tesis indican que la disminución en la expresión de Cx43 inducida por la disminución de la proteína transportadora de PC StarD7 tiene un impacto significativo en la expresión y/o función de otras proteínas. Además, se demostró que el silenciamiento de StarD7 conduce a alteración en la morfología del aparato de Golgi y en la localización del MTOC contribuyendo a una desregulación en la homeostasis celular. Finalmente, es importante destacar que las Cxs desempeñan un papel esencial en el desarrollo y la función del sistema reproductivo femenino de los mamíferos. Por lo tanto, los resultados de este trabajo de tesis resaltan la importancia de explorar el rol de StarD7 en patologías placentales.

Summary: The StarD7 lipid transporter protein belongs to the START-domain protein superfamily. The evolutionarily preserved expression of these proteins in different species highlights their importance in lipid intracellular transport, metabolism and signaling. It is widely demonstrated the contribution of StarD7 to maintain cellular homeostasis, participating in the transport of phosphatidylcholine (PC) to the mitochondria, essential for mitochondrial function and morphogenesis. In addition, StarD7 deficiency has been associated with endoplasmic reticulum stress as well as with alterations in cell proliferation and migration. This thesis work analyzed StarD7's contribution to the connexin 43 (Cx43) expression and its participation in polarized cell migration using as a study model the cell line derived from HTR-8/SVneo extravillous trophoblast, which exhibits a marked migratory and invasive phenotype. It was shown that StarD7 silencing leads to a decrease in Cx43 mRNA that correlates with decreased levels of the Cx43 protein. The decrease in the Cx43 protein levels was associated with an increase in the levels of ITGA1, ITGA5, ITGB1 and NID1 transcripts as well as with the protein levels of integrin α1, integrin α5, mature integrin β1, β-catenin, and nidogen-1, and in MMP9 activity. On the other hand, it was shown that StarD7 silencing leads to a decrease in polarized cell migration of HTR-8/SVneo cells with a decrease Twist1 protein levels. In addition, cells with silenced StarD7 were found to have lower adhesion affinity on a fibronectin surface. It was established by immunofluorescence assays that StarD7 silencing leads to a disruption of the Golgi apparatus and alteration in the location of the microtubule organizing center (MTOC) during polarized migration. Recovery assays determined that Cx43 levels are dependent on StarD7 expression levels. Cx43 recovery experiments on StarD7-silenced cells suggest that nidogen-1 levels are dependent on the abundance of the Cx43 protein and that its recovery would restore the polarized cell migration. In summary, the findings of this thesis work indicate that the decrease in the expression of Cx43 induced by the decrease of the PC transfer protein StarD7 has a significant impact on the expression and/or function of other proteins. Additionally, StarD7 silencing leads to alteration on the morphology of Golgi apparatus and also to the location of MTOC contributing to deregulation in cellular homeostasis. Finally, it is important to note that Cxs play an essential role in the development and in the function of the female reproductive system of mammals. Therefore, the results of this thesis work highlight the importance of exploring StarD7's role in placental pathologies.