Utilización de agonistas de receptores tipo toll 3 en escenarios terapéuticos antitumorales

Abstract

Durante la realización de la presente tesis doctoral se estableció un modelo terapéutico preclínico de administración intratumoral (i.t.) de polyadenylic–polyuridylic acid (poli A:U) desnudo, un análogo sintético de ARN doble cadena viral que es reconocido sólo por TLR3 y no por otros receptores citosólicos. Se demostró que el tratamiento terapéutico con poli A:U inhibe el crecimiento tumoral y aumenta la sobrevida en los ratones portadores de tumores de melanoma murino B16 tratados. Asimismo, se demostró que dicho tratamiento puede ser empleado con éxito en similares esquemas terapéuticos en distintos modelos murinos, tanto en el background genético C57BL/6 como en el BALB/c, aportando bases para una terapia alternativa antitumoral. También se estudió la contribución particular que las células del sistema inmune ejercen en nuestro modelo preclínico. Empleando ratones nude e IL-12 p40-/-, se demostró que tanto las células T (y/o NKT) así como la subunidad IL-12p40 (compartida por IL-12 e IL-23) participan en el control del crecimiento tumoral y la sobrevida en los ratones portadores de tumores B16 tratados. Cuando se caracterizó ex vivo el infiltrado inmunológico en tumores de ratones tratados con poli A:U, se encontró un mayor infiltrado de células CD45+, de células dendríticas maduras CD11c+ (CD40+CD86+) productoras de IL-12 y de LiT CD8+, modificándose la relación CD4/CD8 en tumor. Empleando ratones reporteros Foxp3-GFP, se encontró que el tratamiento con poli A:U disminuye el número de células T reguladoras (Treg) en tumor y el porcentaje de células que expresan el marcador LAP, asociado a la producción de TGF-β. Además, se estudió la respuesta antitumoral antígeno específica empleando el modelo preclínico en ratones portadores de tumores B16 que expresan de forma estable ovalbúmina (OVA), mediante la transferencia adoptiva de células T CD4+ y CD8+ provenientes de ratones transgénicos OTI y OTII (que expresan TCR específicos para péptidos de OVA expresados en el contexto del CMH clase I y II respectivamente). Se evidenció que el tratamiento i.t. con poli A:U promueve el reclutamiento y la proliferación de LiT CD8+ antígeno específicos en ganglio drenante y favorece un perfil de respuesta Th1 antígeno específica en tumor. Por otra parte, mediante el empleo de nuestro modelo preclínico en ratones deficientes en el receptor de IFN-I (IFNAR1-/-) se demostró que se requiere la señalización de IFN-I sobre las células huésped para observar la inhibición del crecimiento tumoral y el aumento de la sobrevida generada por el tratamiento con poli A:U. Además, cuando se caracterizó ex vivo el infiltrado leucocitario en tumor en ratones IFNAR1-/-, todas esas diferencias halladas entre los tratamientos en ratones wt se pierden. Para demostrar que el tratamiento con poli A:U induce la producción endógena de IFN-β, se emplearon ratones reporteros que expresan el gen de luciferasa en lugar de la secuencia codificante de IFN-β. El estudio de la cinética de la inducción de IFN-β in vivo demostró que el tratamiento i.t. con poli A:U desnudo es capáz de inducir un pico de dicha citocina luego de 6 h y que este se produce a lo largo de sucesivas dosis. Empleando cepas de ratones reporteros de IFN-β específicos para distintos linajes como células mieloides, dendríticas, LiT y B (LysM+/loxβLuc, CD11c+/loxβLuc, CD4+/loxβLuc y CD19+/loxβLuc respectivamente), se demostró que luego del tratamiento con poli A:U las células de origen mieloide son responsables de producir la totalidad de IFN-β en el microambiente tumoral y que las células CD11c+ también contribuyen en gran parte con dicha inducción. Además, se reprodujo el modelo preclínico en ratones reporteros de IFN-β deficientes en UNC93B1 (molécula involucrada en el tráfico de TLR endosomales) y en IRF3, 5 o 7 (factores de transcripción clave en las vías de señalización de TLR). De esta manera, se demostró que la producción de IFN-β en nuestro modelo preclínico, es dependiente de IRF3 y UNC93B1 pero no de IRF7 e IRF5, confirmando que poli A:U es ligando TLR3 y contribuyendo también con algunos aspectos importantes de su señalización in vivo. Por último, se evaluó el empleo de poli A:U en combinación con un quimioterapéutico convencional como doxorrubicina, con el fin de disminuir su dosis, manteniendo la eficacia del tratamiento y disminuyendo sus efectos adversos. Para ello, se empleó doxorubicina en altas y bajas dosis i.v. en ratones portadores de tumores B16 y se mantuvieron las condiciones y el esquema experimental de administración de poli A:U. La terapia combinada poli A:U y doxorubicina bajas dosis demostró tener un efecto sinérgico favorable, respecto a los demás tratamientos empleados, para el control del crecimiento tumoral y el aumento de la sobrevida de los ratones tratados, reduciendo además los efectos tóxicos secundarios de doxorubicina evaluados mediante niveles ezimáticos y parámetros bioquímicos. La presente tesis revela el rol crucial de la inducción endógena de IFN-β, luego de la administración i.t. de poli A:U, en la modificación del tipo de infiltrado, funcionalidad de células del sistema inmune y en la respuesta inmune antitumoral que promueve el control del crecimiento tumoral y el aumento de la sobrevida de los ratones tratados