Aspectos moleculares y celulares de la interacción de ɑ2-macroglobulina con su receptor específico LRP1 : implicancias en la migración celular

Abstract

La α2-Macroglubilina (α2M) y su receptor específico LRP1 (del inglés low density lipoprotein receptor-related protein 1) tienen una activa participación en la remodelación de la matriz extracelular (MEC) así como también en la migración y la proliferación celular. La α2M, a través de su acción inhibitoria sobre un amplio espectro de proteasas, actúa como reguladora de la proteólisis extracelular. Si bien se conoce que el complejo α2M-proteasa (α2M*) se une a LRP1, es internalizado a través de un mecanismo de endocitosis mediado por clatrina y degradado en lisosomas, al presente no ha sido completamente esclarecido a qué nivel de su ruta de internalización se disocia de LRP1, así como tampoco qué tipo de reciclado endocítico sigue este receptor luego de la disociación. El estudio del transporte intracelular de α2M* y LRP1 es clave para el entendimiento de las diversas acciones celulares que cumple este sistema molecular, principalmente en lo que respecta a la activación de las vías de transducción de señales. Por otra parte, se conoce que la interacción α2M*/LRP1 regula la actividad de las metaloproteinasas de matriz (MMP) MMP-2 y MT1-MMP, las cuales participan activamente en los procesos migratorios y de formación de lamelipodios en células gliales de Müller retinales. No obstante, aún restan dilucidar cuáles son los mecanismos moleculares y celulares que regulan la actividad de estas MMP a nivel de la superficie celular. Teniendo en cuenta estos antecedentes, el objetivo general del presente trabajo de tesis fue investigar aspectos moleculares y celulares de la interacción de α2M* con su receptor específico LRP1. Dentro de este marco general se pretendió dilucidar si α2M* cumple algún rol en la regulación del transporte intracelular de LRP1, así como también en la inducción de la migración celular. Para ello se abordaron los siguiente objetivos específicos: 1) investigar el transporte intracelular de α2M* y LRP1, caracterizando a) la ruta de internalización de α2M*, b) la distribución y localización subcelular de LRP1 en presencia de α2M*, y c) el reciclado endocítico y/o la exocitosis de LRP1 desde vesículas intracelulares hacia la membrana plasmática; y 2) evaluar mecanismos moleculares y celulares por los que α2M* induce el incremento de la migración celular. De este modo, este trabajo de tesis presenta una nueva perspectiva en el estudio bioquímico y celular de la participación de α2M y LRP1 en el control de la proteólisis extracelular y la activación del componente celular implicado en la remodelación de la MEC. Estos eventos tienen lugar durante la progresión de diversos procesos fisiológicos y patológicos, tales como la angiogénesis y la retinopatía isquémica proliferativa (entre otras, retinopatía diabética proliferativa, retinopatía del prematuro y retinopatía asociada a anemia falciforme). Como modelo experimental se utilizó la línea de células gliales de Müller aisladas de retinas humanas y espontáneamente inmortalizadas, MIO-M1, las cuales expresan de manera constitutiva el receptor LRP1. Mediante la realización de ensayos de microscopía confocal se caracterizó el transporte intracelular de α2M* y LRP1 en células MIO-M1. Se observó que α2M* siguió una ruta de internalización a través de endosomas de sorting y endosomas tardíos, la cual culminó con su degradación en lisosomas, a diferencia de lo observado para LRP1, el cual no se detectó en compartimentos de degradación. Además, luego del estímulo con α2M*, el nivel de LRP1 en la membrana plasmática incrementó significativamente, lo cual fue evidenciado mediante microscopía TIRF, citometría de flujo y ensayos de biotinilación de proteínas de membrana plasmática seguidos de inmunoprecipitación. Cabe destacar que la expresión de una dominante negativa de la proteína motora intracelular con actividad GTPasa Rab11 (Rab11S25N-GFP), en células MIO-M1, no impidió el incremento de LRP1 en la superficie celular luego del estímulo con su ligando. Por otro lado, mediante el uso de ensayos de migración en la herida y zimografía, se demostró que α2M* indujo el incremento de la motilidad celular y la activación de proMMP-2 en células MIO-M1. Estos procesos fueron bloqueados cuando LRP1 y MT1-MMP se silenciaron con técnicas de siRNA y shRNA. Por otra parte, mediante el uso de microscopía confocal y procedimientos bioquímicos, se observó que α2M* indujo la acumulación de LRP1 y MT1-MMP en endosomas de sorting, seguido por el reciclado endocítico y la redistribución intracelular de MT1-MMP en las protuberancias celulares. Además, el uso de Rab11S25N-GFP inhibió el reciclado endocítico de MT1-MMP, la migración celular y la activación de proMMP-2 inducida por α2M*. En conclusión, la interacción α2M*/LRP1 indujo la migración de células gliales de Müller por un mecanismo dependiente de Rab11, el cual involucra el transporte intracelular de MT1-MMP a la membrana plasmática.