Fosfolipasas de veneno de yarará chica : clonado, expresión funcional y análisis de hidrólisis de sustrato en monocapas aire/agua

Abstract

El marco general del trabajo presentado en esta tesis fue el estudio de propiedades proteicas claves en la interacción con interfases lipídicas. El objetivo particular fue aportar información sobre las causas de las diferencias de actividad lipolítica de isoformas de enzimas fosfolipasas A2 de veneno de Yarará Chica o Bothrops diporus. Este trabajo continúa la línea investigativa desarrollada en la tesis del Dr. José Julián Daniele, también dirigida por el Dr. Gerardo Fidelio. En aquel trabajo se caracterizaron bioquímicamente tres isoformas de fosfolipasas A2 de Bothrops diporus, siendo notable la diferencia de hidrólisis de monocapas entre una de ellas (P3), respecto a las otras dos (P1 y P2). P3 presentaba una presión lateral óptima de hidrólisis de monocapas de dilauroil-fosfatidil-colina (DLPC) mucho mayor que P1 y P2. En la Parte 1 de esta tesis, se resumen los resultados concernientes al clonado, expresión y renaturalización de dos isoenzimas de Bothrops diporus. Como primer paso se obtuvo la secuencia completa de aminoácidos, deducida a partir del ADN codificante clonado para cada una de ellas. Estas presentan gran similitud entre sí, y se clasifican como de grupo II. Las dos primeras fueron expresadas heterólogamente (E. coli) y renaturalizadas, determinándose su perfil de velocidad de hidrólisis de monocapas de DLPC respecto la presión lateral de esas monocapas. Para ambas isoformas recombinantes, dicho perfil fue coincidente con los obtenidos para las isoformas purificadas de veneno, cuya secuencia completa era desconocida en su momento. Además, se clonó el ADN codificante de una miotoxina con estructura símil a fosfolipasa. A partir de veneno, se purificaron fosfolipasas, encontrándose las dos cuyas secuencias proteicas coinciden con las expresadas en E .coli. Una tercera fosfolipasa fue parcialmente secuenciada a nivel de proteína, siendo distinta de la reportada en el trabajo previo a este (P3), y también diferente en su N-terminal a las dos clonadas. Su perfil hidrolítico en monocapas también difiere aunque es similar al de P3, descripto en el trabajo fundador de esta línea. La información de secuencia de esta nueva isoespecie, parcial, se logró a través del uso de espectrometría de masas de péptidos post digestión tríptica. La Parte 2 de este trabajo resume los puntos principales de este enfoque. Además, en la Parte 3 se presenta un estudio que relaciona los óptimos experimentales de actividad hidrolítica de monocapas de sustrato (lípido) para una dada fosfolipasa secretada con su energía libre de unión a membrana, siendo esta última obtenida a partir de simulación computacional. Se evidenció una relación directa entre el óptimo de presión lateral de hidrólisis de sustrato en monocapa con un mayor valor absoluto de energía de unión a membrana simulado. Por Resumen general 13 modelado molecular se generaron las posibles estructuras para las enzimas de Bothrops diporus y se calculó su energía de unión a membrana simulada. Este valor fue coherente con la presión lateral óptima de hidrólisis predicha por la relación obtenida con estructuras y óptimos conocidos. Al modelar una enzima quimérica consistente en la secuencia de una de las recombinantes con porciones de sus secuencia reemplazada por los péptidos de la nueva fosfolipasa de alta presión, se obtuvo una energía que se relaciona con un mayor óptimo de hidrólisis. Esto sugiere que esas regiones modificadas in silico podrían ser claves para que una isoespecie se comporte como de “alta presión” lateral. En la Parte 4 se presenta un estudio sobre los cambios estructurales de una membrana natural, la mielina, luego de la acción de diversas fosfolipasas. La información estructural se obtuvo a través de la metodología de difracción de rayos X a bajo ángulo (SAXS). Pudo detectarse un cambio en la estructura de mielina al ser incubada con fosfolipasas, evidenciándose una fase más expandida en coexistencia con la fase regular de mielina a la temperatura medida. No se hallaron diferencias entre fosfolipasas de veneno de víbora y de pancreática porcina. Finalmente, en la Parte 5 se describe una modificación al método usual para medir óptimos de hidrólisis en monocapas. Esta permite mayor sencillez en la configuración experimental respecto del método de barostato. Consiste en hacer medidas de la caída de presión lateral de una monocapa de dilauroil-fosfatidil colina y encontrar el punto de inflexión de la curva expresada como moléculas superficiales vs. tiempo. El tiempo al que se da este punto de inflexión permite obtener la presión lateral óptima, es decir, a la cual es máxima la velocidad de hidrólisis.