Compuestos naturales fotosensibilizantes como potenciales agentes antifúngicos sobre biofilms

Abstract

En las últimas décadas, la incidencia de las infecciones fúngicas invasivas por patógenos oportunistas ha aumentado, asociada con altas tasas de morbi-mortalidad. Candida tropicalis se ha informado como uno de los patógenos más comúnmente aislado, presentando alta capacidad de formación de biofilms. Esta forma de crecimiento de las levaduras estaría involucrada en la generación de resistencia a la mayoría de todos los antifúngicos utilizados en la actualidad. En este contexto, la Terapia Fotodinámica antimicrobiana (TFDa) se presenta como una alternativa, ya que busca inactivar microorganismos mediante una foto-oxidación biológica mediada por especies reactivas de oxígeno (ERa). El objetivo de esta tesis doctoral fue identificar compuestos naturales fotosensibilizadores, con efecto antifúngico sobre biofilms de C. tropicalis, aplicando protocolos de inactivación fotodinámica in vitro. Se evaluó la fotoinactivación in vitro de biofilms de C. tropicalis por la acción de extractos y antraquinonas (AQs) aisladas de una planta fototóxica, Heterophyllaea pustulata Hook f. (Rubiaceae). Asimismo, se estudió si el efecto observado está relacionado con el estrés oxidativo y nitrosativo como consecuencia de los mecanismos fotosensibilizantes. Para ello, se evaluó la generación de ERa y especies reactivas del nitrógeno, así como las defensas antioxidantes enzimáticas y no enzimáticas del sistema biológico estudiado. Se demostró que el efecto antibiofilm de los extractos bajo la acción de la luz está relacionado con el alto contenido de AQs fotosensibilizadoras. A su vez, las principales AQs presentes en el extracto fotoactivo, rubiadina y 1-metil éter de rubiadina, exhibieron un significativo efecto antibiofilm sólo bajo irradiación, el cual fue dependiente de la cepa de C. tropicalis estudiada (cepa clínica CRF6 y cepa de referencia NCPF 3111). Estas AQs produjeron 63,5 y 47 % de reducción (%R), respectivamente, sobre el biofilm de la cepa de referencia, y ambas generaron un 82,1 - 81,8 %R sobre el biofilm de la cepa clínica. A su vez, se estableció que este efecto fue mediado por un marcado desbalance oxidativo y nitrosativo, siendo rubiadina más activa que su derivado metilado. Esto se observó tanto sobre la cepa de referencia como sobre la cepa clínica, ya que para alcanzar los porcentajes de reducción arriba mencionados, fueron necesarias menores concentraciones de rubiadina. La evaluación de los mecanismos fotodinámicos Tipo I (producción de radical anión superóxido, 020 -) y Tipo II (generación de oxígeno singlete, 102) indicó que la reducción del biofilm de C. tropicalis por ambas AQs bajo irradiación, está mediado principalmente por un significativo aumento en la producción de O2'- (Tipo 1). Si bien se observó la producción de 102 en biofilms, su participación en la fotoinactivación seria insignificante. Asimismo, como consecuencia de la elevada generación de 02'- se detectó un incremento en los niveles de óxido nítrico. Probablemente como una respuesta a esta ERO, generando un estrés nitrosativo que también estaría involucrado en el efecto antibiofilm. La activación de las defensas antioxidantes (enzimáticas y no enzimáticas) del biofilm estaría contrarrestando el estrés oxidativo y nitrosativo, produciendo una importante reducción en la biomasa, sin lograr la erradicación de los mismos. Por otro lado, se pudo incrementar el efecto antibiofilm de 1-metil éter de rubiadina sobre la cepa de referencia (62,9 %R) con períodos consecutivos de irradiación (15 min de luz) durante la incubación (O, 3, 6, 24, 27 Y 30 h), dado que alcanzó un mayor porcentaje de acumulación en el biofilm respecto a rubiadina a las 3 h de incubación (22,4 % vs 1,22 %). A su vez, se demostró que cada AQ podría utilizarse combinada con Anfotericina B (AMB), ya que al ser irradiadas potenciaron la actividad de este antifúngico sobre biofilms de C. tropicalis. De esta forma, las AQs podrían usarse en concentraciones por debajo de la Concentración Inhibitoria Mínima fotoactiva, lo cual permitiría disminuir los efectos secundarios de AMB. Similar potenciación se observó cuando ambas AQs fueron combinadas entre sí y fotoestimuladas. Incluso se potenció aún más la actividad antibiofilm de las combinaciones cuando se aumentó la frecuencia de irradiación, específicamente para 1-metil éter de rubiadina se logró un 82 %R. Por lo tanto, el desbalance de los sistemas de defensa antioxidante junto con la TFDa, podría ser una nueva estrategia para mejorar la actividad de los agentes antifúngicos como AMB, convirtiéndose en una alternativa para el desarrollo de tratamientos antifúngicos más eficaces. En conclusión, ambas AQs naturales, rubiadina y 1-metil éter de rubiadina, lograron fotoinactivar biofilms de C. tropicalis, ya sea solas o combinadas con AMB. Por lo tanto, poseen potencial aplicación en l.FDa para el tratamiento de infecciones generadas por biofilms de C. tropicalis