Estudio de adaptadores monométricos en el transporte de proteinas a vacuolas lisosomales en Giardia Lamblia

Abstract

En este Trabajo de Tesis, hemos identificado un solo gen en Giardia que codifica una proteína que contiene el dominio conservado ENTH, el cual define a la familia de adaptadores monoméricos del tipo epsina. Este módulo está presente tanto en epsina como en las proteínas relacionadas a epsina (epsina R), cuyas funciones en la mayoría de las células eucariotas están relacionadas a la endocitosis y el transporte de proteínas desde el Golgi hacia los endosomas, respectivamente. En este estudio, encontramos que GIENTHp (del inglés §.iardia [amblia ENTH protein) está presente en el citosol y, de la misma manera que epsina, se asocia con la subunidad alfa de la AP-2, clatrina y ubiquitina, interactúa fuertemente con PI3,4,SP3 y participa en la endocitosis mediada por receptor. También hallamos que GIENTHp se une la subunidad gamma de AP-l Y PI4P Y está implicada en el tráfico desde el sitio de direccionamiento hacia las vacuolas lisosomales o PVs, tal como las proteínas del tipo epsinaR. Observamos asimismo que la alteración en la función de GIENTHp afecta gravemente el crecimiento trofozoítos, mostrando además una acumulación inusual de material electrodenso en las PVs, lo que indica que GIENTHp podría estar implicada en el mantenimiento de la homeostasis de estas vacuo las. Por otra parte, debido a que muchos componentes de la maquinaria endocítica son estructural y funcional mente conservados entre los organismos eucariotas, es que se utilizó el sistema de levaduras para explorar las similitudes como así también las particularidades de GIENTHp como un miembro de la familia ENTH. En teste Trabajo de Tesis, investigamos también si La doble función de GIENTHp como epsina y epsinaR es conservada, utilizando como modelo la levadura S. cerevisiae que expresa dos homólogos de epsina, Entl y Ent2, y dos ortólogos de epsinaR, Ent3 y EntS. Encontramos que la expresión de GIENTHp (o solo su dominio de ENTH) no complementó el crecimiento de las levaduras en la cepa mutante entlLlent2Ll ni restauró el defecto en el transporte vesicular en en t3Llent5Ll. Sin embargo, hallamos que la proteína en estudio actúa como una proteína no funcional dominante de Ent3jS en la cepa de tipo salvaje, observando un defecto en la localización CPSl y en la maduración de la feromona de apareamiento, el factor-a. Así, el hallazgo de que GIENTHp actúa como una proteína dominante negativa de epsinaR en células de levadura, refuerza los datos filogenéticos que muestran que GIENTHp pertenece a la subfamilia epsinaR, la cual estaba presente en todos los organismos eucariotas previo a su evolución en diferentes taxas.