Análisis del rol de muts en la regulación del acceso a la replicación de la adn polimerasa de baja fidelidad IV en pseudomonas aeruginosa /

Abstract

En la presente Tesis Doctoral se caracterizó a nivel molecular y funcional un nuevo mecanismo presente en la bacteria patógena Pseudomonas aeruginosa, el cual interrelaciona dos de los principales procesos metabólicos del ADN: la replicación y la reparación. Particularmente, se estudiaron tres proteínas: MutS del “Sistema de reparación de bases apareadas en forma incorrecta” (Mismatch Repair ó MMR) y dos proteínas replicativas, el factor de procesividad  clamp y la ADN Polimerasa (Pol) IV. Por un lado, MutS inicia el proceso de reparación ya que reconoce y se une a la base mal apareada (MM) reclutando los factores involucrados en las etapas subsiguientes. Por otro lado,  clamp es un anillo que envuelve al ADN y mantiene unidas a las Pols aumentando su procesividad. Mientras que Pol IV es una Pol alternativa de baja fidelidad capaz de aliviar bloqueos en la replicación debido a la presencia de lesiones en el sustrato de ADN (Síntesis de Translesión, TLS), MMs o ciertos contextos de secuencia. Previamente, en el laboratorio se observó una clara asociación entre la proteína MutS y  clamp de P. aeruginosa, la cual no posee un rol importante en las funciones que al momento han sido asignadas a MutS en bacterias. Las evidencias al inicio de esta Tesis indicaban que la función de la interacción MutS- clamp podría ser regular el acceso de Pol IV a los sitios de replicación, lo cual corresponde a un nuevo mecanismo para mantener la fidelidad de la replicación. Sin embargo, no había evidencias de cuáles podrían ser las bases moleculares del mismo, por lo cual el objetivo general fue describir el mecanismo molecular que utiliza MutS para regular el acceso de Pol IV a la replicación. El trabajo se dividió en dos secciones, la primera consistió en ensayos bioquímicos utilizando proteínas recombinantes y en la segunda se estudió este nuevo rol en la mutagénesis de células de P. aeruginosa. En conjunto, los resultados nos llevaron a plantear un modelo molecular mediante el cual MutS regularía el acceso de Pol IV a la replicación. En condiciones normales de crecimiento, Pol IV accede a la replicación mediante su interacción con β clamp cuando Pol III se detiene, aliviando la parada de replicación. Sin embargo, si introduce una base incorrectamente, la interacción MutS -β clamp está favorecida, desplazando a Pol IV de la replicación. Por el contrario, en condiciones estresantes, donde se acumula ADN simple cadena (ADNsc), MutS no controlaría el acceso de Pol IV, promoviendo la posible aparición de mutaciones beneficiosas. Brevemente, las principales evidencias de esta Tesis que apoyan dicho modelo son: (i) Pol IV interacciona mediante el motivo conservado QLxLF con β clamp con menor afinidad que MutS; (ii) MutS no interacciona directamente con Pol IV; (iii) MutS es capaz de desplazar a Pol IV del anillo de  clamp compitiendo por la unión al bolsillo hidrofóbico de  clamp; (iv) Diferentes estructuras de ADN modulan esta función de MutS: MutS mostró un control más estricto sobre la unión de Pol IV a β clamp en presencia de ADN “primeados” (ADNp), mientras que la afinidad de la interacción MutS- β clamp aumenta en presencia de ADNp conteniendo un MM de tipo GT; (v) En condiciones normales de crecimiento, MutS limita a Pol IV cuando realiza replicación mutagénica (ADN no dañado), mientras que no la controla cuando lleva a cabo replicación libre de errores (TLS); (vi) En condiciones de inducción de estrés, MutS no controlaría la acción de Pol IV.