Rol del transporte de citoquinas mediado por proteínas de la familia Azg en la señalización hormonal durante el desarrollo del sistema radical de plantas (2014-2019)
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Date
2019Author
Tessi, Tomás María
Advisor
Desimone, Marcelo
Metadata
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Las plantas han podido conquistar la tierra gracias a su plasticidad
fenotípica. Parte de esta capacidad se explica por la posibilidad de generar
nuevas estructuras a lo largo de la vida. En el presente trabajo se abordo la
importancia de dos genes de la familia AZG (AtAzg1 y AtAzg2 ) en el desarrollo
radical. Los antecedentes mostraban que estos genes codifica para
potenciales transportadores de purinas y de algunos de sus derivados como
las citoquininas. Ademas, experimentos realizados en Arabidopsis thaliana,
señalaron que podrian estar relacionados con la regulacion de la arquitectura
radical en estrecha relacion con los sistemas hormonales de plantas. Partiendo
de esta base, nos propusimos en primer lugar comprender el origen de
la familia genica especialmente en relacion con los sistemas de señalizacion
hormonal. Mediante la busqueda de secuencias relacionadas en el grupo de
Viridiplantae, se pudo obtener el primer arbol logenetico con los potenciales
homologos de los genes de A. thaliana. La posibilidad de contar con
un arbol permitido avanzar sustancialmente en el conocimiento acerca de la
evolucion de esta familia genica. Se pudo relacionar la diversi cacion de la
familia con eventos especificos como la conquista de la tierra y la aparicion
de la raiz, asi como tambien se observo que los origenes de algunos sistemas
de señalizacion coinciden con los de la familia genica AZG. Por otro lado,
contar con gran numero de genes homologos de la familia, nos permite poner
en relevancia secuencias altamente conservadas, asi como señalar regiones
que expliquen las diferencias entre las variantes de los distintos genes de la
familia AZGs.
En el presente trabajo se continuo con la caracterizacion de los miembros
de AZG de A. thaliana, AtAZG1 y AtAZG2, al estudiar la capacidad
de ambos transportadores de interactuar con otras proteinas en el sistema
de expresion heterologo de levaduras. Para ello, se realizaron ensayos de interaccion
usando la tecnica de Split Ubiquitin System. En primer lugar, se
pudo establecer que los transportadores son capaces de interactuar tanto
consigo mismos como con el otro miembro de la familia. Es decir, se observaron
asociaciones del tipo AZG1-AZG1, AZG2-AZG2 y AZG1-AZG2. Por
otro lado, result o de inter es conocer la capacidad de estos transportadores
de interactuar con algunos miembros de la cascada de senalizacion por citoquininas,
por lo que se seleccionaron como candidatos los receptores y las
fosfotransferasas. Si bien la interaccion de estas proteinas con AZGs habria
resultado un interesante mecanismo de respuesta rapida para la regulacion
del transporte de la hormona, no se observo interaccion entre AZGs con
receptores de citoquininas y la interaccion con las fosfotransferasas no fue
concluyente.
A continuacion, se estudio el rol de estos transportadores en plantas. En
primer lugar, se avanzo en la caracterizacion de la expresion de AZG1. Se
pudo determinar que este gen se expresa en diversos organos y tejidos y
que es inducible por exposicion a citoquininas. El estudio de distintas lineas
mutantes del gen AtAzg1, mostraron que no existen diferencias evidentes
en sus fenotipos al crecer en condiciones estandar. Sin embargo, motivados
por observaciones hechas durante la descripcion de la expresion, se estudio
la importancia del gen en la dominancia apical radical. Gracias a esto, se
determino que AZG1 es importante para regular la regeneracion del sistema
radical tras la escision del meristema apical radial. Para continuar el estudio
de la relacion de este gen con citoquininas, se estudio como se desarrollan
los mutantes del gen en presencia de la hormona. Se pudo determinar que
la arquitectura radical era distinta en lineas carentes del gen, asi como en
lineas que lo sobreexpresan, especialmente en el largo de la raiz principal.
Para asegurar que esta diferencia se debe a la actividad de transportador
se complementaron lineas deficientes en el transportador (knock-out), las
cuales recobraron el fenotipo salvaje.
Por otro lado se continuo con la caracterizacion de AZG2 en plantas.
Si bien existian estudios previos sobre la expresion del gen, en el presente
trabajo se pudieron profundizar y determinar que su expresion esta limitada
solamente en un pequeño grupo de celulas rodeando los primordios de raiz
lateral, correspondientes a la corteza y la epidermis. Ademas, se determino
que existe otro dominio de expresion del gen en semillas en proceso de germinacion
. Retomando su relacion con hormonas, se observo que en lineas
knock-out mediante el reportero de citoquininas ARR5pro:GUS existan diferencias
en la señalizacion, especialmente tras la aplicacion de la hormona.
Esta diferencia en la señalizacion pudo ser cuantificada mediante el reportero
de citoquininas TCSnpro:GFP. Este reportero mostro que lineas que no
tienen AZG2 presentan menor actividad de citoquininas, relacionando asi los
fenotipos descritos previamente para estas lineas al deficit en la señalizacion.
Finalmente, se abordo el estudio de la localizacion subcelular de los transportadores
mediante el uso de proteinas AZG fusionadas a proteinas
uorescentes.
AZG1 present o una clara localizacion en la membrana plasmatica en
las distintas fusiones con proteinas
uorescentes evaluadas. Por otro lado, la
fusion con AZG2 fue localizada en la membrana plasmatica, aunque tambien
se observo señal en el citosol. Mediante el uso de distintas construcciones
y observando distintos tejidos, se pudo estimar que se tratara de reticulo
endoplasm atico.
Los resultados obtenidos en el presente trabajo permiten profundizar el
conocimiento sobre el vinculo entre estos transportadores y la señalizacion
hormonal en plantas. Se lograron establecer modelos que nos permiten explicar
la actividad de ambos transportadores, contemplando su posicion en el
contexto de señalizacion, su dominio de expresion asi como su localizacion y
su relacion con otras vias de señalizaci on. Como perspectivas, el estudio permitio
abrir nuevas puertas a proyectos de investigacion en curso que apuntan
hacia el mejor entendimiento de la regulacion de la arquitectura radical.
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