El factor de transcripción KLF6 regula la proliferación, fusión y migración de las células trofoblásticas

Abstract

RESUMEN La placenta es un órgano temporal clave durante el embarazo ya que ejerce la conexión entre la madre y el feto por lo que su correcta formación y funcionamiento es fundamental para el bienestar fetal y el progreso del embarazo. El desarrollo temprano de la placenta humana se considera, en algunos aspectos, similar a la carcinogénesis. Ambos se desarrollan en un ambiente con bajos niveles de oxígeno, su desarrollo es modulado por el sistema inmunológico, la expresión de protooncogenes, microARNs y genes supresores tumorales. Además, las células placentales y tumorales tienen una alta capacidad para proliferar, fusionarse, migrar e invadir. La principal diferencia entre la progresión del cáncer y el desarrollo de la placenta es que, en esta última, estos procesos están estrictamente regulados. La desregulación de algunos de estos procesos se asocia con complicaciones del embarazo como preeclampsia, retardo del crecimiento intrauterino, placentas cretas, entre otras. Durante el desarrollo placentario las células progenitoras de la placenta, los citotrofoblastos (CTB), proliferan rápidamente y comienzan a diferenciarse, algunas para dar origen por fusión celular al sinciciotrofoblasto (STB) multinucleado y algunas hacia el trofoblasto extravelloso migratorio y altamente invasivo que permite anclar la placenta al útero materno. KLF6 es un factor de transcripción ubicuo con un dominio de transactivación ácido N-terminal y un dominio de unión al ADN tipo dedos de zinc C-terminal. KLF6 es altamente expresado en la placenta. Los ratones Klf6-/- mueren en el día embrionario 12,5 mostrando deterioro del desarrollo de la placenta. Previamente, se demostró que KLF6 es necesario para la fusión célula-célula en cultivos primarios de citotrofoblastos vellosos (CTBv), así como en la línea celular BeWo derivada de trofoblasto y modula la expresión de la proteína inhibidora del ciclo celular p21, de sincitina-1 (Syn-1) y de la subunidad β de la gonadotrofina coriónica humana (β-hCG). Además, la inmunoreactividad de KLF6 es mayor en el lecho placentario de las placentas provenientes de embarazos con preeclampsia que en las de los embarazos sin complicaciones. Sin embargo, se desconoce el mecanismo por el cual KLF6 regula la diferenciación del CTBv y no existen reportes sobre el rol de KLF6 en el proceso de migración e invasión de los citotrofoblastos extravellosos (CTBev). En contextos tumorales, KLF6 actúa como un gen supresor de tumores. De hecho, la disminución en los niveles de KLF6 aumenta la tumorigenicidad y la metástasis en numerosos tipos de cáncer. No obstante, también se ha informado el efecto contrario en células normales y cancerosas. En esta tesis se estudió el mecanismo por el cual KLF6 participa en la diferenciación de los CTBv los cuales fusionan para formar el STB. Se demostró que KLF6 es suficiente para desencadenar la fusión de células BeWo. Además, KLF6 incrementó la expresión de moléculas importantes involucradas en este proceso, entre ellas β-hCG, Syn-1 y p21, y disminuyó la proliferación celular. Mientras que, una mutante de KLF6 que carece del dominio ácido, implicado en la actividad transcripcional (KLF6Δac), disminuyó la sincicialización in vitro de cultivos primarios de CTBv, así como, la expresión de Syn-1 y β-hCG. Además, la fusión celular desencadenada por KLF6 se redujo en células silenciadas para p21. Estos resultados sugieren que KLF6 induce la sincicialización de CTBv a través de un mecanismo que involucra su dominio regulador de la transcripción de una manera dependiente de p21. Por otro lado, se demostró que KLF6 está involucrado en la diferenciación del CTBev. La disminución en la expresión de KLF6 o la sobreexpresión de la mutante carente del dominio acídico (KLF6Δac) incrementó la migración, la actividad de la metaloproteinasa 9 y la expresión de moléculas importantes involucradas en la migración y la transición epitelio-mesenquimal (EMT), como β-catenina, conexina-43, integrinas α5 y β1. Además, provocó cambios morfológicos compatibles con la EMT confirmados por estudios de microscopía de fuerza atómica y Raman. En línea con los datos obtenidos in vitro, se demostró que placentas cretas, caracterizadas por ser anormalmente invasivas, poseen niveles de inmunomarcación para KLF6 más bajos con mayor localización citoplasmática en comparación con placentas normales. Los resultados obtenidos en esta tesis sugieren que KLF6 es un regulador maestro de la diferenciación celular en la vía sincicial y que su dominio de transactivación N-terminal es necesario para esta función. Mientras que, en la diferenciación de los CTBev, KLF6 actúa regulando negativamente la migración a través de la modulación de la expresión de moléculas importantes involucradas en este proceso. En resumen, los resultados actuales permiten proponer a KLF6 como un regulador clave de la diferenciación del trofoblasto a través de la vía vellosa y extravellosa, y sugieren que la desregulación en su nivel de expresión o la pérdida de su actividad transcripcional contribuiría al desarrollo de patologías como preeclampsia y placentas cretas.

ABSTRACT The placenta is a key temporary organ during pregnancy. It establishes critical relationships between the mother and the fetus, so its correct formation and functioning is essential for fetal well-being and the outcome of the pregnancy. Early human placental development resembles carcinogenesis in otherwise healthy tissues. The placental and tumor development share numerous features. Both take place in an environment with low levels of oxygen, their development is modulated by the immune system and the expression of protooncogenes, microRNAs and tumor suppressor genes. Furthermore, placental and tumor cells have a high capacity to proliferate, fuse, migrate and invade. The main difference between cancer progression and placenta development is the tight regulation of these processes in the placenta. However, the dysregulation of these processes is associated with pregnancy complications such as preeclampsia, intrauterine growth restriction and placentas cretas, among others. During development, placental progenitor cells, the cytotrophoblasts (CTB), rapidly proliferate and begin to differentiate, some towards the villous pathway to form the multinucleated syncytiotrophoblast (STB) by cell-cell fusion and some towards the highly invasive and migratory extravillous trophoblasts (EVT) that anchor the placenta to the uterus. KLF6 is a ubiquitous transcription factor with an N-terminal acidic transactivation domain and a C‐terminal zinc finger DNA-binding domain. KLF6 is highly expressed in placenta. Klf6-/- mice die at day E12.5 showing impaired placenta development. Previously, it was demonstrated that KLF6 is required for cell–cell fusion in primary culture of human villous cytotrophoblasts (vCTB) isolated from term placenta, as well as in the BeWo trophoblast-derived cell line and it modulates the expression of the cell cycle inhibitory protein p21, syncytin-1 (Syn-1), and the β subunit of the human chorionic gonadotropin (β-hCG). Additionally, KLF6 immunoreactivity is higher in the placental bed of preeclamptic pregnancies than in those of uncomplicated pregnancies. However, the mechanism by which KLF6 regulates CTBv differentiation is unknown and there are no reports about the role of KLF6 in the process of migration and invasion of the EVT. In cancer, KLF6 acts mainly as a tumor suppressor gene. Indeed, KLF6 knockdown increases the tumorigenicity and metastasis in numerous types of cancer. Nevertheless, the opposite effect has been also reported in normal and cancer cells. In this thesis, the mechanism by which KLF6 participates in CTB differentiation through the villous and extravillous pathways was explored. It was demonstrated that KLF6 is sufficient to trigger cell fusion and to increase the expression of important molecules involved in this process, such as β-hCG, Syn-1 and p21, in addition, it downregulates cell proliferation. Furthermore, a KLF6 mutant lacking the acidic domain involved in its transcriptional activity (KLF6Δac) impaired the in vitro syncytialization of villous trophoblast cells isolated from human term placentas and decreased Syn-1 and β-hCG expression. Moreover, cell fusion triggered by KLF6 was reduced in cells silenced for p21. These results suggest that KLF6 induces vCTB syncytialization through a mechanism that involves its regulatory transcriptional domain in a p21-dependent manner. Additionally, the KLF6 involvement in EVT differentiation was established. The decrease in KLF6 expression or the overexpression of the transcriptionally inactive mutant (KLF6Δac) increase cell migration, metalloproteinase 9 activity, and the expression of molecules involved in migration and epithelial mesenchymal transition (EMT) such as β-catenin, connexin-43, integrin α5 and β1. In addition, it causes morphological changes consistent with EMT, confirmed by atomic force microscopy and Raman studies. In line with the data obtained in vitro, it was shown that placentas cretas, characterized by being abnormally invasive, have lower KLF6 immunostaining levels and more cytoplasmic localization compared to normal placentas. The results obtained in this thesis suggest that KLF6 is a master regulator of cell differentiation into the syncytial pathway and that its N-terminal transactivation domain is required for this function. While in EVT differentiation, KLF6 negatively regulates migration by modulating the expression of important molecules involved in this process. In summary, current results allow proposing KLF6 as a key regulator of trophoblast differentiation through the villous and extravillous pathways and suggest that dysregulation in its expression level or the loss of its transcriptional activity may contribute to the development of pregnancy pathologies like preeclampsia and placentas cretas.