Caracterización funcional de la proteína StarD7 : aspectos bioquímicos, celulares y moleculares

Abstract

La proteína StarD7 (START domain containing 7) pertenece a la superfamilia de proteínas con dominio START, que se caracteriza por unir y/o transportar moléculas lipofílicas, participando en el transporte, metabolismo y señalamiento intracelular lipídico. Mutaciones de alguno de los genes que codifican para estas proteínas con dominio START y/o modificaciones en la expresión están asociadas a procesos patológicos, desórdenes genéticos, enfermedades autoinmunes y tumores. En este trabajo de tesis se realizaron diferentes aproximaciones experimentales a los fines de comprender el rol de StarD7 en la fisiología celular. Se utilizaron modelos de líneas celulares trofoblásticas derivadas de coriocarcinoma (JEG-3 y BeWo), la línea HTR8/SVneo derivada de tejido placental de primer trimestre y otras líneas celulares epiteliales. Inicialmente se realizó en la línea celular JEG-3 un análisis global de la expresión de transcriptos evaluando el efecto del silenciamiento de StarD7. Los resultados demostraron expresión diferencial de un gran número de genes, entre estos: Cnx43, TWIST1, MBD2, TGFRII, ABCG2, THSD7A, SMURF2, KDELC1 y NID1 fueron validados mediante qRT-PCR. Estos hallazgos podrían conducir a identificar genes candidatos dependientes de StarD7 probablemente relacionados a su función celular. Se demostró, en todas las líneas celulares silenciadas con siRNA contra StarD7, una disminución en los niveles del transcripto y la proteína ABCG2 (ATP binding cassette subfamily G member 2) el cual codifica para un transportador de eflujo de lípidos/xenobióticos. Por el contrario se observó que la sobre-expresión de StarD7 aumenta los niveles proteicos de ABCG2, indicando una correlación positiva entre ambas proteínas. Además, las células deficientes de StarD7 presentaron una menor actividad del transportador y mayor susceptibilidad a la droga antineoplásica mitoxantrona. Ensayos de inmunofluorescencia y de microscopía electrónica en células silenciadas contra StarD7 revelaron fragmentación del aparato de Golgi con una marcada alteración en las estructuras subcelulares: con retículo endoplásmico (RE) dilatado, desorden en el sistema de endomembranas y numerosas mitocondrias con morfología anormal localizadas alrededor del núcleo. Estos resultados se acompañaron con una disminución en la biosíntesis de novo de fosfolípidos y cambios en la expresión de proteínas y genes involucrados en la respuesta de estrés del RE. Adicionalmente se demostró que las células silenciadas fueron más sensibles a una injuria estresora con una mayor producción de especies reactivas del oxígeno e incremento en los niveles de la enzima antioxidante hemo oxigenasa-1. Además, se observó que la depleción de StarD7 conduce a una disminución en la proliferación y migración celular, aumentando la adhesión celular. A su vez, en las líneas de origen trofoblástico JEG-3 y BeWo se observó un incremento en la diferenciación celular. Finalmente, ensayos de inmunoprecipitación de proteínas de células que sobre-expresan StarD7 y análisis de espectrometría de masa, permitieron identificar algunas proteínas que interactuarían con StarD7. Entre estas posibles moléculas se ubican ubiquitin ligasas tipo Cul3, proteínas adaptadoras de Cul3 (con dominios KLHL, BTB o KELCH, sugiriendo que StarD7 podría regular la actividad de Cul3. Adicionalmente StarD7 interactuaría con el complejo argonauta GW182 (TNRC6A y B). En resumen en este trabajo de tesis se ha demostrado que la proteína transportadora de lípidos StarD7 participa y contribuye a mantener tanto la homeostasis intracelular así como los procesos fisiológicos fundamentales de proliferación, migración y diferenciación celular. Estos hallazgos fueron confirmados en diferentes líneas epiteliales tanto de origen trofoblástico como no trofoblástico sugiriendo que StarD7 tiene un rol funcional conservado.