Estudio de los mecanismos celulares y moleculares que afectan la sobrevida intracelular de streptococcus pneumoniae

Abstract

Streptococcus pneumoniae (neumococo) es la principal causa de morbi-mortalidad en el mundo ya que ocasiona infecciones del tracto respiratorio medio, como otitis y sinusitis, y otras más severas como meningitis, neumonía y sepsis. Este patógeno Gram positivo coloniza la nasofaringe de forma asintomática y tiene la capacidad de diseminarse a los pulmones pudiendo acceder a la circulación sanguínea sistémica desde el espacio alveolar. En este proceso la bacteria interacciona con las células epiteliales pulmonares y el endotelio vascular de los capilares alveolares. Luego de la adhesión de neumococo a células epiteliales, se promueven los eventos de internalización e invasión. Sin embargo, no se conocen los mecanismos moleculares que tienen lugar en dichos procesos. Por lo tanto, se llevaron a cabos estudios orientados a elucidar vías de señalización bacterianas y factores claves para los procesos de internalización y sobrevida de neumococo. Los resultados obtenidos en la presente tesis aportan evidencias concretas de que neumococo pone en marcha una serie de procesos que le permiten mantenerse viable dentro de células A549 y RAW264.7 por varias horas, lo cual beneficia al proceso infectivo. Durante la endocitosis, la maduración de aquellas vesículas que contienen bacterias se acompaña de un recambio de proteínas de tráfico celular y de una disminución gradual del pH (de 6,5 a 4,5). Estudios previos en nuestro laboratorio, han demostrado in vitro que en respuesta al pH ácido S. pneumoniae activa mecanismos que contribuyen a favorecer la liberación de compuestos de la pared celular, ADN y factores de virulencia. Sin embargo, se desconocen los efectos de la acidificación intracelular en el proceso de infección. En el presente trabajo se demostró, mediante el uso de inhibidores de la acidificación (bafilomicina A1 y cloroquina), que el pH ácido lisosomal es un factor necesario para la sobrevida intracelular de la bacteria. En estas condiciones, neumococo activa mecanismos de respuesta al estrés ácido que involucran a los sistemas de dos componentes (TCS): CiaRH y ComE. Estos TCS activan mecanismos opuestos en la bacteria: mientras que CiaRH es esencial para la respuesta de tolerancia al estrés ácido (ATR) promoviendo la sobrevida, ComE es fundamental en el desarrollo de lisis inducia por estrés ácido (ASIL). Sin embargo, el efecto de ATR predomina sobre el de ASIL y promueve la sobrevida de neumococo dentro de células A549. Estos hallazgos aportan conocimientos sobre la respuesta bacteriana bajo condiciones de estrés como las que deben enfrentar en los tejidos del hospedador, donde las bacterias necesitan sobrevivir a fin de establecer infecciones. Para dilucidar el rol que cumplen los diferentes sistemas de señalización bacterianos en contexto de la relación huésped-patógeno, además de CiaRH y ComE, se estudiaron los demás TCS de neumococo y se identificaron a MicB, HK03, HK04, HK06, HK11, ComE y RitR como parte de la respuesta bacteriana al proceso de internalización, y a RitR y HK09 relacionados a la sobrevida intracelular en cultivos celulares. Por otra parte, se conoce que S. pneumoniae y el virus influenza A (IAV) interactúan cooperativamente causando infecciones respiratorias más severas que pueden conducir a la muerte, aunque aún no se han descripto los mecanismos moleculares por los cuales ocurre este fenómeno. En este trabajo se demostró que neumococo percibe cambios intracelulares ocasionados por una infección previa con IAV, que incrementan la internalización y sobrevida de la bacteria. Se identificó a la quinasa bacteriana VisH como proteína clave para el incremento de sobrevida de neumococo específicamente en células infectadas con IAV. Se ha visto que esta histidín quinasa detecta variaciones en la concentración de serina del medio de cultivo, pudiendo ser ese el cambio sensado dentro de las células infectadas por IAV. Por otra parte, si bien ambos patógenos por separado inducen acumulación de autofagosomas en células A549, se encontró que en la coinfección los niveles de LC3-II disminuyen después de 3 h de infección bacteriana. Este hallazgo indica que el mecanismo de autofagia está involucrado en la interacción sinérgica entre ambos patógenos. Además, la ausencia de VisH en la bacteria impide que los niveles de LC3-II disminuyan, sugiriendo que esta proteína está implicada en la disminución de los autofagosomas durante la coinfección con el virus. Estos hallazgos permiten explicar una parte de esta interacción biológica compleja entre ambos patógenos, y brinda caminos alternativos para futuras búsquedas de blancos terapéuticos.