Cribado fenotípico para el desarrollo y reposicionamiento de fármacos contra células tumorales deficientes en BRCA1 y BRCA2

Abstract

BRCA2 es un gen supresor de tumores muy caracterizado, cuya deficiencia contribuye al desarrollo de varios tipos de cáncer en seres humanos. A pesar del éxito clínico de los inhibidores de PARP (poli ADP-ribosa polimerasa) en el tratamiento de cánceres deficientes en BRCA, la aparición de mecanismos de resistencia expone la necesidad de buscar nuevos blancos para la inducción de letalidad sintética (LS) en futuros proyectos de desarrollo de fármacos. En esta tesis, nos enfocamos en BRCA2 con el objetivo de identificar interacciones de LS utilizando una colección de compuestos derivados de plantas. Haciendo uso de una plataforma de cribado de alto rendimiento previamente desarrollada en nuestro laboratorio, se analizó una colección de 66 compuestos puros provenientes de plantas nativas y naturalizadas de América del Sur. A partir de este cribado se identificó a Solanocapsina, un alcaloide esteroideo, como un inductor selectivo de LS. Además, en colaboración con el Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal (IMBIV-CONICET) se derivaron múltiples análogos químicos de Solanocapsina que fueron caracterizados en su capacidad de inducir LS. Mediante experimentos de dosis respuesta comparando células deficientes y proficientes en BRCA2, se encontró que el análogo NorAdS mejoró notablemente la potencia de Solanocapsina. Utilizando dos métodos quimioproteómicos complementarios, se identificó a deoxicitidina quinasa (dCK), una enzima limitante de la vía de reciclaje de nucleótidos, como el blanco de Solanocapsina y NorAdS. Validamos este hallazgo utilizando un inhibidor altamente específico de dCK (DI-87), el cual también indujo LS en distintos contextos deficientes de BRCA2. Es importante destacar que la LS inducida por dCK difiere mecanísticamente de la inducida por los inhibidores de PARP. La inhibición de dCK indujo niveles considerablemente más bajos de daño al ADN y los fenotipos citotóxicos se asociaron exclusivamente con la mitosis, lo que sugiere que la precisión en el suministro de nucleótidos durante la mitosis es crucial para la supervivencia de las células deficientes en BRCA2. Además, se desarrolló un modelo de xenoinjerto en ratones, en los cuales se implantaron tumores deficientes en dCK y tumores dobles deficientes para dCK y BRCA2, en flancos opuestos del mismo ratón. Como resultado, se demostró que la inhibición de dCK, en contextos deficientes en BRCA2, es suficiente para desencadenar LS in vivo. Un objetivo complementario de esta tesis fue desarrollar una nueva metodología de cribado basada en microscopía de fluorescencia de alto rendimiento (HCI, del inglés: High Content Imaging) que permita identificar interacciones letales sintéticas en contextos deficientes en BRCA1. Esta plataforma fue generada con células que expresan proteínas fluorescentes fusionadas a histonas que, además de permitir la identificación de células BRCA-proficientes y deficientes, permite obtener información adicional de textura nuclear. Adicionalmente esta plataforma incluye una marcación para la histona γH2AX que permite monitorear inducción de daño en el ADN y estrés replicativo. A partir de un cribado piloto utilizando inhibidores de la respuesta al daño al ADN (DDR), se observó que las drogas Mitoxantrona y Doxorrubicina indujeron LS en contextos deficientes para BRCA1. Esta información nos permitió validar nuestra plataforma ya que esta interacción había sido previamente reportada. Por otro lado, se identificó a Topotecan, Etopósido y Tenipósido, como drogas inductoras de LS en contextos BRCA1 deficientes. Aunque todavía no se ha avanzado en estudios de validación que confirmen estos hallazgos, estas aproximaciones preliminares demuestran la capacidad de cribado de la plataforma desarrollada. En conjunto, esta tesis identifica a dCK como un nuevo y prometedor blanco terapéutico para los cánceres deficientes en BRCA2, sentando así las bases para futuras opciones terapéuticas que complementen a los inhibidores de PARP. Además, se concluyó el desarrollo de una nueva herramienta de cribado, la cual podrá ser utilizada para identificar nuevos compuestos con capacidad de inducción de LS que puedan usarse para el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos para el tratamiento de cánceres BRCA-deficientes.

BRCA2 is a well-established cancer driver in several human malignancies, the deficiency of which contributes to the development of several types of cancer in humans. While the remarkable success of PARP inhibitors proved the clinical potential of targeting BRCA deficiencies, the emergence of resistance mechanisms underscores the importance of seeking novel Synthetic Lethal (SL) targets for future drug development efforts. In this thesis, we performed a BRCA2-centric SL screen with a collection of plant-derived compounds. Utilizing a high-throughput screening platform previously developed in our laboratory, a collection of 66 pure compounds from native and naturalized plants of South America was analyzed. This screening led to the identification of Solanocapsine, a steroidal alkaloid, as a selective inducer of SL. Furthermore, in collaboration with the Multidisciplinary Institute of Plant Biology (IMBIV-CONICET), multiple chemical analogs of Solanocapsine were derived and characterized for their ability to induce LS. Through dose-response experiments comparing BRCA2-deficient and proficient cells, it was found that the NorAdS analog significantly improved the potency of Solanocapsine. The use of two complementary chemoproteomic approaches led to the identification of the nucleotide salvage pathway enzyme deoxycytidine kinase (dCK) as Solanocapsine‘s and NorAdS‘s target responsible for its BRCA2-linked SL induction. Additional confirmatory evidence was obtained using the highly specific dCK inhibitor (DI-87), which induced SL in multiple BRCA2-deficient and KO contexts. It‘s important to highlight that dCK-induced SL is mechanistically different from the PARP inhibitors. dCK inhibition generates substantially lower levels of DNA damage, and cytotoxic phenotypes are associated exclusively with mitosis, thus suggesting that the fine-tuning of nucleotide supply in mitosis is critical for the survival of BRCA2-deficient cells. Additionally, a xenograft model was developed in mice, in which BRCA2-proficient and BRCA2-deficient tumors with concomitant dCK knockdown were implanted on opposite flanks of the same mouse. As a result, we show that dCK impairment in BRCA2-deficient contexts suffices to trigger SL in vivo. A complementary objective of this thesis was to develop a new screening methodology based on high-throughput fluorescence microscopy to identify synthetic lethal interactions in BRCA1-deficient contexts. This platform was fine-tuned using cells expressing histone-associated fluorescent proteins, which allowed us to identify BRCA2-proficient and BRCA2-deficient cells and obtain additional information about nuclear texture. Additionally, this platform includes labeling for γH2AX, which enables the monitoring of DNA damage and replicative stress induction. From pilot screening using DNA damage response (DDR) inhibitors, it was observed that the drugs Mitoxantrone and Doxorubicin induced synthetic lethality in BRCA1-deficient contexts. This information allowed us to validate our platform, as this interaction had been previously reported. Furthermore, Topotecan, Etoposide, and Teniposide were identified as synthetic lethal drugs in BRCA1-deficient contexts. Even though there remain more validation assays to perform, these preliminary findings prove the platforms‘ screening capacity developed. In conclusion, this thesis unveils dCK as a promising new target for BRCA2-deficient cancers, thus setting the ground for future therapeutic alternatives to PARP inhibitors. In addition, the development of a new screening tool was concluded, which allows us to identify unknown compounds with LS-inducing capacity that can be used to develop of new therapeutic agents for the treatment of BRCA-deficient cancers.