Modificaciones del estado de tirosinación de α-tubulina y microtúbulos por L-Dopa : efectos en la funcionalidad neuronal y su posible participación en neuropatologías

Abstract

En células altamente polarizadas como lo son las neuronas, el citoesqueleto de microtúbulos desempeña un rol esencial en la formación y mantenimiento de la compleja arquitectura celular. Además, constituye las vías de circulación para el transporte intracelular y contribuye a la formación y mantenimiento de conexiones sinápticas. Las modificaciones postraduccionales de tubulina, principal componente de los microtúbulos, representan uno de los principales mecanismos para su especialización funcional. Una de estas modificaciones es el ciclo de detirosinación/tirosinación de α- tubulina, el cual implica la remoción de la tirosina C-terminal de α-tubulina por medio de carboxipeptidasas específicas y su posterior adición mediante la acción de la enzima tubulina tirosina ligasa (TTL). L-Dopa es un análogo estructural de tirosina que actúa como precursor en la síntesis de dopamina y es, hasta el momento, el tratamiento de referencia para la enfermedad de Parkinson. Sin embargo, la administración prolongada de L-Dopa frecuentemente resulta en fluctuaciones en la respuesta motora y el desarrollo de discinesias. Pese a la severidad y a la alta incidencia de los efectos adversos del tratamiento con L-Dopa, los mecanismos subyacentes al surgimiento de las discinesias aún no han sido elucidados. Estudios previos en nuestro laboratorio han demostrado que, debido a su alta homología estructural con tirosina, L-Dopa puede ser incorporada postraduccionalmente en el carboxilo terminal de α-tubulina en lugar de tirosina. Sin embargo, a diferencia de ésta, ensayos en los que se utilizaron diversas líneas celulares y/o microtúbulos purificados sugieren que L-Dopa no es liberada por las enzimas carboxipeptidasas endógenas. Este trabajo de Tesis se centra en analizar el efecto del reemplazo de la tirosina C-terminal de α-tubulina por L-Dopa sobre la funcionalidad de los microtúbulos y su posible participación en procesos neurodegenerativos que podrían estar asociados al desarrollo de discinesias. Utilizamos líneas celulares de origen neuronal y cultivos primarios de neuronas piramidales de hipocampo para evaluar el efecto de la incorporación de L-Dopa en tubulina en procesos esenciales para el mantenimiento de la homeostasis y el correcto funcionamiento neuronal. Asimismo, analizamos el efecto del tratamiento con L-Dopa en neuronas hipocampales proveniente de ratones silvestres y de ratones genéticamente modificados en los que la incorporación de L-Dopa en tubulina es nula o limitada debido a: i) la ausencia de la enzima responsable de su incorporación (TTL KO) o ii) la reducción en la proporción de tubulina detirosinada que sirve como sustrato (SVBP KO). Demostramos que la modificación de tubulina y microtúbulos con L-Dopa produce un retraso en el establecimiento de la polaridad neuronal y altera la morfología de los conos de crecimiento durante las primeras etapas del desarrollo in vitro. Por otra parte, en neuronas maduras, demostramos que el motor molecular KIF5B, involucrado en el transporte axonal de mitocondrias, presenta una menor afinidad por microtúbulos enriquecidos en tubulina-Dopa. Esto impacta negativamente en el transporte y distribución de mitocondrias a lo largo del axón, afectando principalmente al segmento distal. También demostramos que la incorporación postraduccional de L-Dopa en tubulina causa una drástica reducción en la densidad de espinas dendríticas maduras en neuronas piramidales de hipocampo. Por último, mediante ensayos in vitro, utilizando el complejo enzimático VASH1-SVBP recombinante y microtúbulos enriquecidos en tubulina-Dopa evaluamos la irreversibilidad de la incorporación de L-Dopa en tubulina. Encontramos una reducción en el tiempo de residencia de la enzima sobre la superficie microtubular, que se correlaciona con una actividad carboxipeptidasa reducida sobre microtúbulos enriquecidos en L-Dopa. En conjunto, estos resultados nos permiten especular que la administración de L-Dopa por períodos de tiempo prolongados podría dar lugar a su acumulación progresiva e irreversible en tubulina y microtúbulos, afectando procesos neuronales críticos. La alteración en el transporte mitocondrial y la disminución en la densidad de espinas dendríticas podrían estar relacionadas con la disfunción y pérdida de conexiones sinápticas en el cerebro adulto y contribuir a la degeneración axonal. Estos hallazgos plantean la posibilidad de considerar a la incorporación de LDopa en tubulina y microtúbulos como un potencial desencadenante de la disfunción neuronal que podría contribuir al desarrollo de algunos de los defectos neurodegenerativos observados en pacientes con la enfermedad de Parkinson bajo tratamiento prolongado con L-Dopa.

In highly polarized cells such as neurons, the microtubule cytoskeleton plays an essential role in the formation and maintenance of the complex cellular architecture. In addition, it constitutes the pathways for intracellular transport and contributes to the formation and maintenance of synaptic connections. Post-translational modifications of tubulin, the main component of microtubules, represent one of the principal mechanisms for their functional specialization. One of these modifications is the α-tubulin detyrosination/tyrosination cycle, which involves the removal of tyrosine at the C-terminal end of α-tubulin by specific carboxypeptidases and its subsequent incorporation by the tubulin tyrosine ligase (TTL) enzyme. L-Dopa is a structural tyrosine analogue that acts as a precursor in dopamine synthesis and is, to date, the gold standard treatment for Parkinson's disease. However, prolonged administration of L-Dopa frequently results in fluctuations in motor response and the development of dyskinesias. Despite the severity and high incidence of dyskinesias, the mechanisms underlying their emergence have not yet been elucidated. Previous studies in our laboratory have shown that, due to its high structural homology with tyrosine, L-Dopa can be post-translationally incorporated into the Cterminus of α-tubulin instead of tyrosine. However, unlike tyrosine, studies using various cell lines and/or purified microtubules suggest that L-Dopa is not released by endogenous carboxypeptidase enzymes. This Thesis focuses on analyzing the effect of tyrosine replacement at the C-terminus of α-tubulin by L-Dopa on microtubule functionality and its possible involvement in neurodegenerative processes that could be associated with the development of dyskinesias. We used cell lines of neuronal origin and primary cultures of hippocampal pyramidal neurons to evaluate the effect of L-Dopa incorporation into tubulin on essential processes for the maintenance of neuronal homeostasis and function. We also analyzed the effect of L-Dopa treatment on hippocampal neurons from wild-type and genetically modified mice in which L-Dopa incorporation into tubulin is null or limited due to: i) the absence of the enzyme responsible for its incorporation (TTL KO) or ii) the reduction in the proportion of detyrosinated tubulin that serves as a substrate (SVBP KO). We demonstrated that modification of tubulin and microtubules with L-Dopa results in a delay in the establishment of neuronal polarity and alters the morphology of growth cones during the early stages of development in vitro. Moreover, in mature neurons, we showed that the molecular motor KIF5B, involved in axonal transport of mitochondria, has a reduced affinity for tubulin-Dopa-enriched microtubules. This negatively impacts mitochondrial transport and distribution along the axon, mainly affecting the distal segment of the axon. We also showed that post-translational incorporation of L-Dopa into tubulin causes a drastic reduction in the density of mature dendritic spines in hippocampal pyramidal neurons. Finally, by in vitro assays using the recombinant VASH1-SVBP enzyme complex and tubulin-Dopa-enriched microtubules, we evaluated the irreversibility of L-Dopa incorporation into tubulin. We found a reduction in the residence time of the enzyme on the microtubule surface, which correlates with a reduced carboxypeptidase activity on L-Dopa-enriched microtubules. Taken together, these results suggest that prolonged administration of L-Dopa may lead to its progressive and irreversible accumulation in tubulin and microtubules, affecting critical neuronal processes. Altered mitochondrial transport and decreased dendritic spine density may be related to the dysfunction and loss of synaptic connections in the adult brain and contribute to axonal degeneration. These findings raise the possibility of considering LDopa incorporation into tubulin and microtubules as a potential trigger of neuronal dysfunction that could contribute to the development of some of the neurodegenerative defects observed in Parkinson's disease patients under prolonged L-Dopa treatment.