Palmitoilación de proteínas : consecuencias funcionales y aislamiento de inhibidores

Abstract

Las proteínas están sujetas a una gran variedad de modificaciones postraduccionales que impactan tanto en sus propiedades físico-químicas como en sus funciones. Dentro de estas modificaciones, nos enfocamos en la S-acilación, la cual consiste en la adición enzimática de lípidos de cadena larga (en general palmitato) en residuos de cisteínas de proteínas solubles y transmembranas a través de un enlace tioéster lábil. La S-acilación es catalizada por una familia de proteínas denominadas S-aciltransferasas o palmitoiltransferasas (PATs). Las PATs son proteínas politópicas de membranas que contienen entre cuatro y seis segmentos transmembrana y se caracterizan por la presencia de un dominio altamente conservado de aproximadamente 50 aminoácidos, rico en cisteínas, denominado DHHC-CRD (Asp-His-His-Cys Cysteine-Rich Domain). Diversos fenotipos se han asociado a ratones mutantes de DHHCs que muestran la importancia de las enzimas individuales para la fisiología normal. Además, se han informado vínculos entre enfermedades humanas y mutaciones en los genes DHHC o los cambios en sus niveles de expresión, por ejemplo: discapacidad intelectual, esquizofrenia y varios tipos de cáncer. En este trabajo de tesis se abordaron dos proyectos relacionados a la S-acilación. En primer lugar, desarrollamos un sistema de búsqueda de inhibidores in vivo para las PATs de mamíferos DHHC20 y DHHC21, utilizando como modelo la levadura Saccharomyces cerevisiae. El sistema se basa en cepas que poseen un gen reportero bajo el control de un factor de transcripción fusionado a un sustrato de palmitoilación, en consecuencia, la expresión de este gen está directamente relacionada con el estado de acilación de esta quimera. Se analizaron compuestos de la librería 3D Biodiversity (ChemDiv, USA) y se obtuvieron tres moléculas candidatas como posibles inhibidores de la DHHC20. Estas drogas, podrían ser utilizadas como prototipos para el desarrollo de nuevas moléculas con mayor actividad. En segundo lugar, realizamos un estudio de los integrantes de la familia de las proteínas CYSTM de levaduras, la cual comprende los genes: YDL012C, YBR016W, YDR034W-B y YDR210W. Estudios realizados basados en técnicas bioinformáticas proponen que el dominio C-terminal de estas proteínas, rico en cisteínas, podría conformar un dominio transmembrana. Sin embargo, en este trabajo demostramos que miembros de esta familia están palmitoilados, y que esta modificación es la responsable de la unión de estas proteínas a membrana plasmática, lo que indica que este dominio C-terminal no es un dominio transmembrana. Además, mostramos que esta modificación lipídica es importante para la estabilidad de estas proteínas. La pérdida de la PAT Erf2 da como resultado una degradación parcial de Ybr016w, mientras que en ausencia de la PAT Akr1, esta proteína se degrada por completo por la vía del proteosoma. Esta degradación es dependiente de la ubiquitin ligasa Rsp5. Sin embargo, el efecto de la falta de Akr1 en la estabilidad de Ybr016w no se debe únicamente a su supuesta actividad como palmitoiltransferasa, debido a que la degradación de la proteína en una cepa akr1Δ es independiente de la presencia de su dominio CYSTM. Finalmente, se realizaron experimentos para establecer si la falta de alguna de estas proteínas resulta en algún fenotipo mediante ensayos de crecimiento en diferentes medios. Se observó que estos genes podrían estar involucrados en la resistencia a Cd2+ y Zn2+, lo que sugiere un rol en la resistencia al estrés provocado por metales pesados.