Participación del hipotálamo en los efectos de ghrelina sobre la actividad funcional espermática, la espermatogénesis, el éxito reproductivo y la conducta sexual en ratones machos

Abstract

La ingesta de alimentos y la fisiología reproductiva se modulan simultáneamente para optimiza el éxito reproductivo en condiciones metabólicas fluctuantes. Ghrelina (Ghrl), un péptido orexigénico identificado como el ligando endógeno del receptor secretagogo de la hormona del crecimiento, está siendo investigado por su papel potencial en la reproducción. Teniendo en cuenta que los datos disponibles hasta el momento aún son limitados y que la caracterización del mecanismo de acción de Ghrl en el sistema reproductivo no se ha dilucidado completamente, estudiamos la participación del hipotálamo en los efectos de Ghrl en l actividad funcional de los espermatozoides, la espermatogénesis, el éxito reproductivo, la conduct sexual, los niveles de hormonas reproductivas y la expresión de genes relacionados a la fisiología reproductiva en ratones machos después de la administración hipotalámica de Ghrl 0,3 o 3,0 nmol/día o líquido cefalorraquídeo artificial (LCR) en diferentes períodos de tratamiento. Nuestros resultados muestran que la administración de Ghrl 3,0 nmol/día durante 42 día indujo una disminución significativa de la concentración de espermatozoides epididimarios (Ghrl 17,68±2,98 x106/ml vs. LCR 26,91±1,52 x106/ml, p≤0,05) y de la motilidad (Ghrl 56,25±1,80 % vs. LCR 77,67±1,33 %, p≤ 0,05). Además, los espermatozoides de los animales tratados con Ghrl 3,0 nmol/día presentaron cambios morfológicos a nivel de la cabeza: morfología anormal, acrosoma pequeño, cromatina no condensada, lo que sugiere que Ghrl podría afectar a los microtúbulos del manchette que se encuentran en las proximidades del núcleo y participan en la formación de la cabeza, en la compactación de la cromatina y transporte de las proteínas a la cola en desarrollo, y/o los que conforman el axonema, estructura interna del flagelo espermático. Además, el tratamiento con Ghrl durante 42 días disminuyó la expresión de esperiolina, lo cual podría explicar, al menos en parte, la disminución de la motilidad de espermatozoides epididimarios y los cambios morfológicos observados a nivel de la cabeza y la cola. Así mismo, Ghrl disminuyó significativamente el porcentaje de espermatogonias y espermatozoides testiculares (F= 2, 1492; df=12; p≤ 0,05) y estos resultados se asocian con una reducción en la concentración plasmática de hormona luteinizante y testosterona (p≤ 0,05). Al evaluar el impacto de la administración intrahipotalámica de Ghrl sobre el índice de fertilización in vivo y el tamaño de la camada, encontramos que el tratamiento con Ghrl 3,0 nmol/día en los machos, incrementa significativamente el porcentaje de pérdida embrionaria (Ghrl 5,92±1,57 % vs. 1,10±0,75 %, p<0,05) y el número de fetos atrofiados en las hembras que copularon con estos animales (Ghrl 0,72±0,19 vs. 0,14±0,10, p<0,05), sugiriendo que el tratamiento afectó de algún modo la calidad de las gametas masculinas. Al testear la capacidad fertilizante in vitro de los espermatozoides, no se observaron diferencias significativas en el porcentaje de ovocitos fertilizados con respecto a los controles. Estos resultados sugieren que los efectos deletéreos observados podrían relacionarse a etapas posteriores del desarrollo del embrión y/o a una falla en la implantación. La testosterona es una hormona clave para el desarrollo sexual masculino y la conducta sexual. En nuestros resultados se observa que los animales tratados con Ghrl exhibieron un comportamiento dual donde algunos de ellos mostraron una notoria disminución de la motivación en comparación a los controles y a la conducta basal del propio animal. Mientras que otros animales, buscaban más rápido a la hembra y disminuyeron significativamente el tiempo de latencia de eyaculación, sin embargo, una vez producida la eyaculación, estos animales no mostraron nuevo interés por las hembras, por lo que no pudieron reiniciar otro ciclo de cópula. En cuanto a los posibles mediadores implicados en los efectos deletéreos de Ghrl sobre la funcionalidad espermática, los resultados sugieren la participación de kisspeptinas, dado que la administración de Ghrl 3,0 nmol/día indujo una disminución significativa de la expresión relativa del gen responsable de su expresión (Kiss-1) (F=10,25; p≤0,05) y de su receptor GPR54 (F=11,34; p≤0,05). Como Ghrl es un péptido orexigénico, se midió diariamente el peso corporal y la ingesta de alimentos. Los resultados mostraron que Ghrl aumentó ambos parámetros; sin embargo, el efecto no duró más allá de la primera semana de tratamiento, por lo tanto, los efectos observados no son atribuibles a este factor. Los resultados presentados en este trabajo confirman que la administración central crónica de Ghrl deteriora la espermatogénesis y sugieren que este efecto está mediado por la inhibición del eje hipotalámico-hipofisario-gonadal.

Food intake and reproductive physiology are both simultaneously modulated to optimize reproductive success under fluctuating metabolic conditions. Ghrelin (Ghrl), an orexigenic peptide identified as the endogenous ligand of the growth hormone secretagogue receptor, is being investigated for its potential role on reproduction. Considering that data available so far are still limited and characterization of Ghrl action mechanism on the reproductive system has not been fully elucidated, we studied the participation of hypothalamus in Ghrl effects on sperm functional activity, spermatogenesis, reproductive success, sexual behavior, reproductive hormone levels, and gene expression related to reproductive physiology in male mice after hypothalamic infusion of 0.3 or 3.0 nmol/day Ghrl or artificial cerebrospinal fluid (ACSF) at different treatment periods. Our results show that Ghrl 3.0 nmol/day administration for 42 days induced a significant decrease of epididymal sperm concentration ( Ghrl 17.68 ± 2.98 vs. CSF 26.91 ± 1.52 x106 ml, p≤0.05) and motility (Ghrl 56.25 ± 1.80 vs. CSF 77.67 ± 1.33 %, p≤ 0.05). In addition, sperm of animals treated with Ghrl 3.0 nmol/day presented morphological changes at the head level: abnormal morphology, small acrosome, uncondensed chromatin, suggesting that Ghrl could affect the microtubules of the manchette found in the vicinity of the nucleus, and participate in the formation of the head, compaction of chromatin and deliver proteins to the developing tail, and/or those that make up the axonema, internal structure of the sperm scourge. Likewise, Ghrl significantly decreased the percentage of spermatogonia and sperm in testis (F=2, 1492; df = 12; p≤ 0.05) and these results were associated with a significant reduction in luteinizing hormone and testosterone plasma levels (p≤ 0.05). When evaluating the impact of Ghrl intrahypothalamic administration on fertilization rate and litter size in vivo, we found that Ghrl treatment 3.0 nmol /day in males significantly increases the percentage of embryonic loss (Ghrl 5.92±1.57 % vs. 1.10±0.75 %, p<0.05) and the number of atrophied fetuses in females that copulated with these animals (Ghrl 0.72±0.19 vs. 0.14±0.10, p<0.05). This suggests that treatment somehow affected the quality of the male gametes. When testing the in vitro fertilizing capacity of sperm, no significant differences were observed in the percentage of fertilized oocytes with respect to controls. These results suggest that deleterious effects observed could be related to later stages of embryo development and/or to a failure in implantation. Testosterone is a key hormone for male sexual development and sexual behavior. As seen in our results, animals treated with Ghrl exhibited a dual behavior where some of them showed a marked decrease in motivation compared to the controls and the basal behavior of the animal itself. While others looked for the female faster and significantly reduced the ejaculation latency time, however, once the ejaculation occurred, these animals showed no new interest in females, so they could not restart another intercourse cycle. Regarding the possible mediators involved in the deleterious effects of Ghrl on sperm functionality, results suggest the participation of kisspeptins, since administration of Ghrl 3.0 nmol/day induced a significant decrease in relative expression of the gene responsible for its expression (Kiss-1) (F = 10.25; p≤0.05) and of its GPR54 receptor (F = 11.34; p≤0.05). As Ghrl is an orexigenic peptide, body weight and food intake were measured daily. Results showed that Ghrl increases both parameters; however, the effect did not last beyond the first week of treatment, therefore the observed effects are not attributable to this factor. Results presented in this work confirm that chronic central Ghrl administration impairs spermatogenesis and suggest that this effect is mediated by inhibition of hypothalamic–pituitary– gonadal axis.