Ingeniería de vectores plasmídicos para bacterias ácido lácticas

Abstract

Las bacterias ácido lácticas representan microorganismos de gran valor alimentario, biomédico e industrial. Su aislamiento, caracterización y modificación son objeto de gran demanda, ya que sirven como potenciales probióticos, biofactorías de expresión recombinante o como vectores vivos de estrategias terapéuticas. Las herramientas más importantes para estudiar las bacterias ácido lácticas y/o desarrollar cepas con nuevas propiedades son los sistemas basados en plásmidos. El objetivo de esta tesis fue la generación y estudio de plásmidos para optimizar su uso como herramientas versátiles de marcaje fluorescente, expresión génica y modificación génica para bacterias ácido lácticas. Se empleó la bacteria Lactococcus lactis MG1363 como huésped modelo. En primer lugar, generamos y caracterizamos nuevos vectores con elementos funcionales en varios huéspedes bacterianos. Analizamos comparativamente las propiedades de un conjunto de vectores de marcaje fluorescente construidos mediante la combinación de: replicones promiscuos de la familia de pMV158 (pMV158 o pSH71), una gama de promotores constitutivos o inducibles funcionales en bacterias ácido lácticas, genes que codifican una proteína fluorescente (mCherry o EGFP) y diferentes marcadores de resistencia a antibióticos (EryR, CmR o TcR). Se determinó la carga metabólica que la presencia de dichos vectores impone a la célula bacteriana, la funcionalidad del sistema de expresión en varios huéspedes, las propiedades in vivo de las proteínas fluorescentes y el funcionamiento de los replicones en L. lactis (número de copias y estabilidad plasmídica). Estos vectores permiten el marcaje y la expresión génica estable o transitoria con una amplia variedad de niveles de expresión. En segundo lugar, se construyeron vectores de herencia inestable para la modificación génica de L. lactis utilizando el sistema CRISPR-Cas9 en vectores con el replicón promiscuo pAMβ1 y promotores regulados por pH para la expresión del gen de la nucleasa Cas9. Se caracterizó la funcionalidad del sistema, la carga metabólica asociada y las características del plásmido en L. lactis (número de copias y estabilidad plasmídica). Estos vectores permitieron la selección eficiente de cepas por curado de plásmido y selección de mutantes cromosómicas. Finalmente, se logró eliminar de forma exitosa el sistema de modificación para obtener cepas modificadas y libres de plásmidos. La presente tesis comprende la construcción y caracterización de nuevos vectores plasmídicos funcionales en una amplia gama de huéspedes. Se demostró que el estudio de las características plásmido/huésped de los vectores empleados en las estrategias basadas en plásmidos permite optimizar el diseño y utilización de los mismos para cada aplicación.

Lactic acid bacteria represent microorganisms of great food, biomedical, and industrial value. Their isolation, characterization, and modification are in high demand, as they serve as probiotics or valuable recombinant microbial cell factories and live vectors for delivery of therapeutic strategies. Plasmid-based systems are essential tools for the development of lactic acid bacteria with novel properties. The objective of this thesis was to generate and study plasmids to optimize their utility as versatile tools for fluorescent labeling, gene expression and gene modification of lactic acid bacteria strains, employing Lactococcus lactis MG1363 as model host. Initially, we generated and characterized new vectors harboring functional elements in various bacterial hosts. A comprehensive analysis was conducted on a set of fluorescent labeling vectors constructed by combining promiscuous replicons of the pMV158 family (pMV158 or pSH71), a range of constitutive or inducible promoters functional in lactic acid bacteria, genes encoding fluorescent proteins (mCherry or EGFP), and different antibiotic resistance markers (EryR, CmR, or TcR). Evaluation of the metabolic burden imposed by these vectors on bacterial cells, the functionality of the expression system in different hosts, the in vivo properties of the fluorescent proteins, and the performance of replicons in L. lactis (copy number and plasmid stability) was determined. These vectors enable stable or transient labeling and gene expression with a wide range of expression levels. Subsequently, gene modification systems for L. lactis were constructed using the CRISPR-Cas9 system in vectors carrying the promiscuous replicon pAMβ1 and pH-regulated promoters for the expression of the Cas9 nuclease gene. We characterized the functionality of the system, the associated metabolic burden, and the plasmid features (copy number and plasmid stability) in L. lactis. These vectors allowed efficient selection of strains modified through plasmid curing or chromosome mutation. Finally, the gene-editing system was successfully eliminated to obtain plasmid-free strains. In summary, this study involved the construction and characterization of new plasmid vectors functional in a wide range of hosts. It demonstrated that studying the plasmid/host characteristics of vectors used in plasmid-based strategies allows for optimized design and utilization of these vectors for each specific application.