Participación de proteínas quinasas en el desarrollo y persistencia de chlamydia trachomatis

Abstract

Chlamydia trachomatis (CT) es la bacteria de transmisión sexual que produce el mayor número de infecciones en el mundo. CT puede causar graves secuelas a través de la cronificación de la infección. Las complicaciones más importantes de la infección por CT se deben de una deficiencia en la respuesta inmune, que no logra eliminar el patógeno generando inflamación y cicatrización de tejidos sensibles, configurando un proceso que frecuentemente acaba en infertilidad femenina. Como bacteria intracelular obligada, CT intercepta diferentes vías de tráfico vesicular de la célula huésped para adquirir lípidos esenciales para su supervivencia y replicación, particularmente desde el aparato de Golgi a través de un transporte mediado por Rab14. Los mecanismos moleculares que subyacen a la forma en que esta bacteria manipula el transporte intracelular son objeto de intenso estudio. En el desarrollo de esta tesis mostramos que CT utiliza la vía de señalización AKT/AS160 para promover la llegada de esfingolípidos a la inclusión clamidial a través del transporte vesicular controlado por Rab14. CT provoca la fosforilación de AKT a lo largo de todo su ciclo vital y reclutando a AKT fosforilada (pAKT) a la membrana de la inclusión. Como consecuencia, el sustrato de AKT de 160 kDa (AS160), también conocido como TBC1D4, una proteína activadora de GTPasas (GAP) para Rab14, se fosforila y, por tanto, se inactiva. AS160 fosforilada (pAS160) pierde su capacidad de promover la hidrólisis de GTP, favoreciendo la unión de Rab14 a GTP. En consecuencia, la inhibición de la vía disminuye el tamaño de las inclusiones clamidiales, la multiplicación bacteriana y la infectividad de forma dependiente de la dosis. Para evaluar la respuesta inflamatoria tras la infección y para verificar el posible uso de inhibidores de AKT como fármacos anticlamidiales, establecimos un modelo de infección ex vivo de úteros murinos. Seleccionamos cuatro inhibidores de AKT (iAKT, MK, GSK, AZD), química y funcionalmente diferentes. Mediante diferentes metodologías corroboramos que el uso de los cuatro inhibidores redujo los niveles de TNFα e IL1β desencadenados por la infección CT en los tejidos. Estas dos citoquinas son producidas mayoritariamente por los macrófagos tisulares en este modelo de cultivo ex-vivo. Por este motivo, y con el objetivo de evaluar una potencial actividad antiinflamatoria de la inhibición de AKT, continuamos utilizando un modelo de infección por CT empleando la línea celular RAW246.7. Mediante WB, confirmamos que el TNFα recombinante activó la vía AKT/IκBα en los macrófagos infectados. La incubación de macrófagos infectados y estimulados con TNFα con inhibidores de AKT redujo los niveles de IkBα fosforilada. Para continuar con la evaluación de la cascada de señalización, evaluamos por RT-qPCR la expresión de genes regulados por la vía AKT/IκBα/NFκB (IL1β, TNFα, IL10, IL6). En esta misma línea, evaluamos mediante Citometría de Flujo (FC) el perfil de activación M1/M2 de macrófagos que fueron infectados y luego incubados con inhibidores de AKT o tras el bloqueo de la señalización autocrina de TNFα. Descubrimos que la señalización autocrina del TNFα era esencial para la activación de los macrófagos, mientras que la inhibición del efector rio abajo, AKT, resultaba en una activación sesgada hacia un perfil M2 antiinflamatorio. Además, evaluamos la capacidad de supervivencia de los macrófagos infectados en condiciones de reducción de la actividad de NFκB por la inactivación de AKT. En esta misma línea, el Virus de la Inmunodeficiencia Humana tipo 1 (HIV) infecta a los macrófagos, que son resistentes a los efectos citopáticos de la infección y representan reservorios virales. Numerosos estudios epidemiológicos confirman una gran frecuencia en las coinfecciones por HIV y CT. Un reciente brote de linfogranuloma venéreo (LGV-CT), una cepa de CT, en individuos seropositivos pone de manifiesto el papel de los macrófagos como células estratégicamente atacadas por ambos patógenos. Desarrollamos un modelo de macrófagos derivados de monocitos de sangre periférica humana infectados crónicamente por HIV y CT. Mediante microscopía de fluorescencia y análisis de IFU, descubrimos que el desarrollo y la replicación del CT fueron limitados en los macrófagos infectados crónicamente con HIV. Del mismo modo, la sobreinfección con CT de los macrófagos preinfectados por el VIH disminuyó la proteína p24 viral intra y extracelular y el número de partículas virales infecciosas en el sobrenadante. Curiosamente, la liberación de LDH inducida por la piroptosis activada por CT se redujo significativamente en los macrófagos preinfectados por el HIV. Además, la activación de caspasa-1, AKT y la maduración de IL-1β inducidas por CT se vieron reducidas en las células preinfectadas por HIV, lo que sugiere la persistencia de ambos patógenos en las células coinfectadas a la vez que se reduce la respuesta proinflamatoria de los macrófagos frente a un segundo estímulo bacteriano cuando fueron previamente infectados con HIV. Estos hallazgos sitúan la biología del inflamasoma en el centro del mecanismo fisiopatológico que subyace a esta llamativa coinfección HIV-CT. En conclusión, en esta tesis demostramos que CT, a través de la activación de AKT modifica el transporte vesicular de las células epiteliales que infecta a la vez que modifica la actividad inflamatoria y sobrevida de los macrófagos que parasita. Asimismo, observamos que esta vía era utilizada por HIV y CT en macrófagos humanos, pero la presencia simultánea de los dos patógenos modula la actividad de AKT alterando la biología de los macrófagos y de los patógenos. Esta nueva visión sobre el origen de la respuesta inflamatoria desencadenada por los macrófagos puede tener implicancias impactantes en futuras investigaciones que intenten comprender la inmunopatología que subyace a la enfermedad clamidial y a la coinfección de CT y HIV.

Abstract: Chlamydia trachomatis (CT) represents a major burden in public health systems worldwide as it is the most frequently sexually-transmitted bacterium and as it may cause severe sequelae through the chronification of the disease. The dangerous complications of CT infection are supported by immunopathological responses that fail to eliminate the pathogen while promoting the inflammation and scarring of sensitive tissues, a process that frequently ends up in female infertility. As an obligate intracellular bacterium, CT intercepts different trafficking pathways of the host cell to acquire essential lipids for its survival and replication, particularly from the Golgi apparatus via a Rab14-mediated transport. Molecular mechanisms underlying how this bacterium manipulates intracellular transport are a matter of intense study. Here, we show that CT utilizes AKT/AS160 signaling pathway to promote sphingolipids delivery to the chlamydial inclusion through Rab14- controlled vesicular transport. CT provokes AKT phosphorylation along its entire life cycle and recruits phosphorylated AKT (pAKT) to the inclusion membrane. As a consequence, AKT Substrate of 160 kDa (AS160), also known as TBC1D4, a GTPase Activating Protein (GAP) for Rab14, is phosphorylated and therefore inactivated. Phosphorylated AS160 (pAS160) loses its ability to promote GTP hydrolysis, favoring Rab14 binding to GTP. AKT inhibition by an allosteric isoform-specific AKT inhibitor (iAKT) prevents AS160 phosphorylation and reduces Rab14 recruitment to chlamydial inclusions. iAKT further impairs sphingolipids acquisition by CT inclusion and provokes lipid retention at the Golgi apparatus. Consequently, treatment with iAKT decreases chlamydial inclusion size, bacterial multiplication, and infectivity in a dose-dependent manner. Similar results were found in AS160-depleted cells. By electron microscopy, we observed that iAKT generates abnormal bacterial forms as those reported after sphingolipids deprivation or Rab14 silencing. In a second step, we set up a model of ex-vivo infection of murine uteri to evaluate the inflammatory response upon infection and upon the use of novel anti-chlamydial agents. We selected four chemically and functionally different inhibitors of AKT at different stages of clinical trials based on our experiments confirming their antibacterial activity in vitro. By WB and IHC we corroborated that the use of the four inhibitors reduced the levels of TNFα and IL1β triggered by CT infection of the tissues. These two cytokines are mostly produced by tissular macrophages in this ex-vivo culture model. For this reason, and with the aim of evaluating a potential antiinflammatory activity of AKT inhibition, we continued using a model of CT infection of the RAW246.7 cell line. By WB, we confirmed that recombinant TNFα activated the AKT/IκBα pathway in infected macrophages. Incubation of infected and TNFα-stimulated macrophages with AKT inhibitors reduced the levels of phosphorylated IkBα. To continue with the evaluation of the signaling cascade, we assessed by RT-qPCR the expression of genes regulated by the AKT/IκBα/NFκB pathway (IL1β, TNFα, IL10, IL6). In this same line, we evaluated by FC the M1/M2 activation profile of macrophages that were infected and then incubated with AKT inhibitors or after blockade of the TNFα autocrine signaling. We discovered that TNFα autocrine signaling was essential for the activation of the macrophages while the inhibition of the downstream effector AKT results in the skewed activation toward an anti-inflammatory M2 profile. Moreover, we evaluated the survival capacity of infected macrophages under NFκB pathway blockade by AKT inactivation. We observed by FC an increase in Annexin V staining upon AKT inhibition specially in the infected population in opposition to the bystander macrophages. We confirmed by IF and FACS/WB that the triggered apoptosis occurred in a capase-3 dependent manner. Finally, we corroborated through the use of a model of ex-vivo infection of human explants the anti-chlamydial activity of AKT inhibition. Similarly, the Human Immunodeficiency Virus type-1 (HIV) targets macrophages, which are resistant to the cytopathic effects of the infection and represent viral reservoirs. Extensive epidemiological data support HIV and CT co-infections. A recent outbreak of Lymphogranuloma Venereum (LGV-CT), a CT strain, in HIV-positive individuals highlights the role of macrophages as cells strategically targeted by both pathogens. We developed a model of chronically HIV-infected Human Peripheral Blood Monocyte-derived Macrophages superinfected with LGV-CT. By fluorescence microscopy and IFU analysis, we found that CT development and replication were limited in HIV-positive macrophages. In line with this, CT superinfection of HIV pre-infected macrophages decreased intra and extracellular viral p24 protein and the number of infectious viral particles in the supernatant. Interestingly, CT-induced pyroptotic release of LDH was significantly reduced in HIV-pre-infected macrophages. Furthermore, the CT-induced activation of caspase-1, AKT, and maturation of IL-1β were impaired in HIV pre-infected cells, suggesting the persistence of both pathogens in the co-infected cells. These findings position the biology of the macrophages at the center of the pathophysiological mechanism behind this conspicuous HIV-CT co-infection. In this thesis, we demonstrate that CT, through the activation of AKT manipulates vesicular transport in epithelial cells and modulates the inflammatory and survival programs orchestrated by macrophages. Furthermore, we observed that AKT was activated by both HIV and CT in infected human macrophages; however, the presence of both pathogens within the same macrophage modulates AKT functions altering both the biology of the coinfected cell and the two pathogens, CT and HIV. This novel insight into the origin of the inflammatory response triggered by macrophages may have impactful implications in future research trying to understand the immunopathology that underlies CT and HIV disease.