Estrés celular y acción de antibióticos sobre bacterias productoras de toxinas

Abstract

Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) es un patógeno emergente transmitido por alimentos, asociado frecuentemente a casos de Síndrome Urémico Hemolítico (SUH). En Argentina es endémico con un promedio de 450 a 500 casos por año, siendo el país del mundo con mayor incidencia de esta enfermedad.STEC posee diversos factores de virulencia, pero la acción de la toxina Shiga (Stx) es determinante para la patología del SUH. Recientemente se ha descripto la capacidad de formar biofilms y esto podría ser considerado un factor de virulencia adicional como estrategia de supervivencia.Hasta el presente no existe una terapia específica para el tratamiento de las infecciones por STEC y aunque es susceptible a los antibióticos (ATBs) usados comunmente, la utilización de terapia antimicrobiana es controvertida debido al efecto sobre la inducción del ciclo lítico del fago que contiene los genes que codifican para Stx. Recientes publicaciones sugieren que los ATBs convencionales aumentan el riesgo de SUH en pacientes infectados con STEC debido a que desencadenan en estas bacterias una respuesta SOS que promueve la liberación de Stx. Se ha demostrado que ciertos ATBs no sólo inducen la replicación y expresión de los genes stx, sino que como consecuencia de la lisis bacteriana, también aumentan la liberación de Stx. Sin embargo, estudios clínicos han revelado resultados contradictorios y sigue siendo un tema muy controvertido.Cada vez hay más evidencias de que el mecanismo de muerte celular iniciada por algunos ATBs incluye la producción de especies reactivas del oxígeno (ERO) como mecanismo secundario al mecanismo principal, incluso existen antecedentes que han indicado que el estrés oxidativo constituye una posible causa del daño bacteriano generado por distintos antimicrobianos.En esta tesis doctoral se planteó como objetivo principal esclarecer aspectos metabólicos y fisiológicos en relación al estrés celular que sufren las células del biofilm de STEC al ser sometidas a diferentes condiciones de cultivo. Además, se propuso evaluar la existencia de factores que podrían modificar la liberación de Stx desde el biofilm y la acción de la toxina sobre células sensibles.Los resultados obtenidos permitieron demostrar que diferentes condiciones de cultivo tuvieron influencia sobre la formación del biofilm y se pudo observar que esta formación estuvo directamente relacionada al estrés oxidativo. En condiciones de cultivo que resultaron favorables para la formación del biofilms, como el agregado de glúcidos (glucosa, manosa y maltosa) o un medio reductor (con y sin agregado de azúcares), se evidenció una disminución de ERO y especies reactivas del nitrógeno (ERN) con niveles de enzimas antioxidantes tales como superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT) bajos. En condiciones de cultivo desfavorables como el uso de un agente estresante exógeno o en presencia de ATBs tales como ciprofloxacina (CIP), rifaximina (RIF) y fosfomicina (FOS), la biomasa del biofilms disminuyó; siendo CIP capaz de reducir la misma en mayor medida. También hubo una disminución en las ERO y ERN con aumentos marcados en la actividad de las enzimas SOD y CAT sugiriendo que el desarrollo del biofilm de STEC estaría influenciado por la producción de metabolitos oxidantes y la respuesta de las defensas antioxidantes. Los tres ATBs utilizados mostraron diferencias significativas tanto en la reducción del biofilm como en el desbalance oxidativo siendo más marcado este desbalance con CIP.El uso de secuestrantes utilizados para evaluar el estrés oxidativo causado por CIP en los biofilms de STEC, permitió observar una variación dosis dependiente de la biomasa del biofilm. En presencia de un secuestrante específico de anión superóxido como el Tirón, se evidenció un aumento significativo en la formación del biofilm en todas las concentraciones de CIP estudiadas con respecto al basal sin agregado de antioxidante. Glutatión (un antioxidante no enzimático preformado en las células) y ácido ascórbico (un compuesto capaz de oxidarse cediendo sus electrones y evitando la oxidación de otros compuestos) también disminuyeron el estrés oxidativo generado por CIP. La utilización de estos tres antioxidantes permitió observar un aumento en los niveles de nitritos lo cual indicaría que las ERN también estarían involucradas en la generación del estrés oxidativo inducido por CIP.Además, se evidenció que el biofilm de STEC fue capaz de liberar Stx y esto incrementó cuando éste fue expuesto a una condición estresante (agregado de CIP) ya que el efecto citotóxico de Stx sobre células sensibles como las Vero, aumentó significativamente con el incremento del estrés oxidativo. Se observaron diferencias en la liberación de toxina desde los biofilms de STEC expuestos a los ATBs utilizados, siendo mayor con CIP, mientras que RIF y FOS no modificaron la liberación de toxina o incluso en algunas concentraciones la disminuyeron. Estos resultados corroboran lo encontrado por otros investigadores en bacterias planctónicas quienes describen que los ATBs que actúan sobre la síntesis de ADN aumentan la producción de Stx, mientras que los que actúan sobre la síntesis de proteínas y de la pared celular inhiben la producción de Stx. Por otro lado, indican que la inducción de la replicación de profagos que contienen genes stx ocurre no solo en presencia de ATBs que interfieren con el ADN sino también bajo condiciones de estrés oxidativo. En este trabajo de tesis, la liberación de toxinas pudo ser revertida, al menos parcialmente por agentes exógenos secuestrantes o inhibidores de ERO con un marcado aumento de óxido nítrico, posiblemente porque este último reduce drásticamente la expresión de recA suprimiendo la respuesta SOS bacteriana inducida por agentes que dañan el ADN y de esta manera inhibe la replicación del fago y la expresión de Stx en STEC.En los distintos capítulos de esta tesis doctoral se comprueba el rol del estrés oxidativo en la formación del biofilm de STEC y la liberación de toxina Shiga, concluyendo que existe una relación entre ellos. El estudio de diferentes efectores implicados en la liberación de toxinas durante la formación de biofilms podría contribuir a una mejor comprensión de la patogénesis de STEC.