Bases moleculares de la interacción de la E3 ubiquitina ligasa TRIM7 con glucogenina-1 y su potencial relevancia en el contexto de la glucogenosis tipo XV

Abstract

Resumen: La ubiquitinación es un tipo de modificación postraduccional característico de organismos eucariotas, que requiere de la acción conjunta de las enzimas E1 activadora, E2 conjugadora y E3 ligasa para mediar la transferencia de ubiquitina a una proteína sustrato. TRIM7 es una E3 ligasa que recientemente ha adquirido interés por su rol en diversas patologías, y pertenece a la familia de proteínas TRIM, caracterizadas por un motivo conservado tripartito (TRIM) N-terminal y una región C-terminal variable que puede mediar el reconocimiento de sustratos. Inicialmente, fue identificada como una proteína que interacciona a través de su dominio C-terminal B30.2 (TRIM7B30.2) con glucogenina-1 (GN1). Dicha proteína es responsable de la iniciación de la biosíntesis del glucógeno, por lo que las mutaciones que afectan al gen que la codifica se traducen en un trastorno extremadamente raro denominado glucogenosis tipo XV. El presente trabajo se centró en caracterizar a TRIM7B30.2 por cristalografía de rayos X, y describir detalles sobre las regiones relevantes para la interacción con GN1. La estructura de TRIM7B30.2 reveló un plegamiento de tipo sándwich-β formado por dos láminas β antiparalelas característico de este tipo de dominios, además de presentar una cavidad con carga positiva en la cara cóncava de dicho plegamiento. Adicionalmente, se logró identificar a residuos clave que delimitan la zona involucrada en la interacción con GN1, además de obtener indicios de que el extremo C-terminal de esta última es necesario para su reconocimiento por TRIM7B30.2 y la proteína TRIM7 entera. Otra parte de este estudio se dedicó a conocer el impacto de la mutación patológica Ala16Pro sobre GN1 de conejo, que presenta una alta homología con la proteína humana, mediante el uso de un amplio conjunto de técnicas bioquímicas y biofísicas. El análisis reveló un cambio estructural significativo que ocasionó una disminución de la afinidad por su sustrato y, en consecuencia, de la actividad de la proteína; además de una marcada pérdida de estabilidad. Por último, se buscó conocer si GN1 y sus mutantes patológicas Ala16Pro y Thr83Met, son sustrato de su actividad E3 ligasa; y si esto podría tener un rol relevante en la glucogenosis tipo XV. Los resultados de la reacción in vitro mostraron que la transferencia de ubiquitina no ocurre bajo las condiciones empleadas, sin embargo, se encontró que TRIM7 interacciona con la mutante patológica GN1 Ala16Pro pese al cambio estructural de la proteína, lo que podría implicar a TRIM7 en la vía de degradación de esta mutante, y por ello el estudio será continuado en cultivos celulares.

Abstract : Ubiquitination is a common post translational modification in eukaryotes, which involves an E1 activating enzyme, an E2 conjugating enzyme, and an E3 ligase enzyme; in a process that mediates the transfer of ubiquitin to a substrate protein. TRIM7 is an E3 ligase member of the TRIM protein family, characterized by an N-terminal tripartite motif (TRIM) and a variable C-terminal region that can mediate substrate recognition, that has been recently linked to diverse pathological processes. TRIM7 was initially identified as a glycogenin-1 (GN1) interacting protein, and this interaction involves the C-terminal B30.2 domain of TRIM7 (TRIM7B30.2). GN1 is the protein that initiates glycogen biosynthesis, and mutations in the gene that encodes for this enzyme are involved in the onset of an extremely rare disease known as type XV glycogen storage disease. This work was mainly focused on the characterization of TRIM7B30.2, through the use of X-ray crystallography, and the details of the region involved in the interaction with GN1. The structure of TRIM7B30.2 revealed the characteristic B30.2 domain fold consisting of two β-sheets arranged as a distorted β-sandwich, and a positively charged cavity in the hypervariable region of this domain. Besides, key residues that define the zone of interaction with GN1 were identified, and evidence for the requirement of the latter’s C-terminal region in the binding was found. This study was also focused on the effect of the pathogenic Ala16Pro mutation on rabbit GN1, which displays a high sequence homology with the human protein; and to this end, a wide range of biophysical and biochemical techniques were applied. The analysis revealed a significant structural change which resulted in a decrease in substrate affinity and protein activity, besides a considerable loss of stability. Finally, the thesis was oriented towards analyzing the potential E3 ligase activity of TRIM7 on GN1 and the pathological mutants Ala16Pro and Thr83Met, and its possible functional role on type XV glycogen storage disease. The results have shown that in vitro, TRIM7 does not transfer ubiquitin to GN1 or the mutants in this experimental setup. However, it was found that despite the structural change caused by the mutation, TRIM7 still interacts with the Ala16Pro mutant of human GN1, which might implicate the intervention of TRIM7 in the degradation pathway of this mutant, and for this reason, this study will be continued in cell cultures.