Desarrollo de una molécula de ARN utilizada como control interno de PCR para la detección del ARN del virus de la hepatitis C y de la inmunodeficiencia humana tipo 1 en muestras biológicas

Abstract

La transmisión de enfermedades infecciosas por transfusiones de sangre es un riesgo conocido desde hace varias décadas, diferentes eventos en gravedad y frecuencia de transmisión fueron asociados a la sangre y sus derivados. Dichos acontecimientos generaron la necesidad de implementar medidas orientadas a incrementar la seguridad de las transfusiones sanguíneas y de los productos derivados del plasma. La utilización de técnicas basadas en la amplificación de ácidos nucleicos (NAT) para la detección de virus transmisibles por vía sanguínea, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ha permitido disminuir significativamente el margen en el riesgo residual biológico debido a que las mismas permiten detectar de forma directa y más temprana el agente infeccioso respecto de las técnicas serológicas comúnmente empleadas. Los virus principalmente asociados a transmisión por hemoderivados (HD) son el virus de la hepatitis C (VHC), virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1), virus de la hepatitis B (VHB), parvovirus humano B19 (B19) y virus de la hepatitis A (VHA), entre otros. Una de las condiciones imprescindibles para garantizar la calidad de un resultado obtenido por PCR es la incorporación de un Estándar Interno o Control Interno (CI) que permita monitorear la presencia de resultados falsos negativos y detectar los resultados verdaderos negativos. En este trabajo de Tesis se describe el diseño y desarrollo de un CI de tipo ARN (ARN/CI) aplicado a la detección del ARN del VHC (ARN/VHC) en plasma y HD mediante una RT-Nested-PCR in house competitiva (Nested-PCR/VHC). Además, se describen las condiciones metodológicas óptimas para la utilización del mismo en la detección del ARN del VIH-1 (ARN/VIH-1) en plasma y HD mediante una RT-Nested-PCR in house no competitiva (Nested-PCR/VIH-1), así como también en la detección simultánea de ambos virus en un mismo ensayo mediante una RT-Nested-PCR múltiple in house (multiplex Nested-PCR/VHC+VIH-1). El CI es una molécula quimérica de ácido ribonucleico compuesta por una secuencia perteneciente a la región 5’ no codificante (5’NC) del genoma del VHC y por otra perteneciente a una secuencia de diseño único, insertada en la anterior. Las condiciones experimentales de aplicación han sido optimizadas para que el CI sea adicionado al inicio del ensayo con el propósito de detectar resultados falsos negativos mediante el seguimiento de las etapas de extracción, purificación, retrotranscripción, amplificación, detección e identificación de los ácidos ribonucleicos virales mencionados. Adicionalmente, se establecieron las condiciones óptimas de almacenamiento del CI, así como también las condiciones experimentales requeridas para su aplicación en plasma humano y derivados plasmáticos. El impacto del desarrollo tecnológico propuesto es de relevancia debido al bajo costo y complejidad requeridos, tanto para la síntesis y almacenamiento del CI, como para su implementación en las técnicas mencionadas, en comparación con las técnicas comerciales disponibles en el mercado. La calidad de la molécula sintética, la adaptación a técnicas de PCR para la detección simple y simultánea de ácidos ribonucleicos virales, la versatilidad de aplicación en diversas matrices biológicas, los bajos requerimientos económicos y los altos beneficios en materia analítica, permiten disponer de un reactivo esencial y accesible para el aseguramiento de la calidad de técnicas de amplificación de ácidos nucleicos.