Pirazolotriazinas : síntesis y estudio como inhibidores enzimáticos

Abstract

En este trabajo de Tesis Doctoral se abordó el estudio teóricoexperimental de pirazolo[1,2,3]triazinas. En una primera instancia, se sintetizaron los precursores 5- amino-pirazol-4-carbonitrilos y 4-amino-pirazol-3-carbonitrilos aplicando las metodologías de calentamiento convencional e irradiación por microondas. Los rendimientos obtenidos fueron de moderados a muy buenos en ambos casos. Además, la síntesis asistida por microondas presentó la ventaja de reducir los tiempos de reacción de horas a minutos. A partir de los amino-pirazol-carbonitrilos, se sintetizaron pirazolo[3,4-d][1,2,3]triazin-4-onas y pirazolo[4,3-d][1,2,3]triazin-4- onas, mediante la diazotación de los compuestos de partida en medio ácido. Los rendimientos obtenidos fueron de buenos a muy buenos para el primer grupo de pirazolotriazinonas, mientras que para la segunda serie fueron moderados. Adicionalmente, se realizó un estudio teórico y experimental del mecanismo de reacción para la termólisis en benceno a reflujo de los núcleos de pirazolo[3,4-d][1,2,3]triazin-4-onas. Así, se estudió la formación de 3-(5-amino-1H-pirazol-4-carbonil)-3,7-dihidro-4Hpirazolo[ 3,4-d][1,2,3]triazin-4-onas a nivel de teoría CAM-B3LYP/6- 311+G(d,p) y se intentó comprobar experimentalmente uno de los intermediarios planteados en la reacción de termólisis. En la segunda parte de esta Tesis Doctoral, se evaluaron los núcleos sintetizados previamente como inhibidores de distintas enzimas. Las dianas estudiadas fueron: tirosinasa, xantina oxidasa (XO) y glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK-3). Aquellos compuestos que resultaron activos se estudiaron mediante docking molecular, para determinar su modo de unión con la proteína, y así describir las interacciones más importantes ligando-receptor. Entre las series de compuestos evaluados, solo los 5-aminopirazol- 4-carbonitrilos resultaron inhibidores de tirosinasa, con valores de IC50 en el rango de micromolar y milimolar (IC50 = 320-3242 μM). Algunos de ellos presentaron valores de inhibición próximos al inhibidor de referencia, el ácido kójico. Por otro lado, derivados de pirazolo[3,4-d][1,2,3]triazin-4-onas y pirazolo[4,3-d][1,2,3]triazin-4-onas mostraron ser buenos inhibidores de XO, con actividades en el orden de micromolar y submicromolar (IC50 = 0,9-8,5 μM). Las simulaciones de docking de dichos compuestos permitieron describir el modo de unión y las principales interacciones con los residuos de la región catalítica de XO para ambas series de compuestos. Mediante evaluaciones in vitro, los compuestos pirazolo[4,3- d][1,2,3]triazin-4-onas resultaron ser inhibidores del orden de micromolar a submicromolar (0,8-4,0 μM) de GSK-3, una enzima asociada a la enfermedad de Alzheimer (EA). Además, a través de experimentos de cinética enzimática, se determinó que estos derivados actúan como inhibidores ATP competitivos. La capacidad de los compuestos activos para atravesar la barrera hematoencefálica (BHE) por difusión pasiva, se evaluó mediante la metodología PAMPA (Parallel Artificial Membrane Permeability Assay). Como resultado se obtuvo que los compuestos que presentaron una buena inhibición de GSK-3 atravesarían la BHE por difusión pasiva. De esta manera, las pirazolo[4,3-d][1,2,3]triazin-4- onas capaces de penetrar la BHE, podrían ser consideradas como candidatos para futuros estudios en modelos in vivo para el tratamiento de la EA. Para complementar los ensayos in vitro con estudios de modelado molecular, se determinó el modo de unión ligando-proteína de los núcleos de pirazolotriazinonas activos mediante simulaciones de docking y se identificaron las principales interacciones con los residuos de la GSK-3. Asimismo, se realizó un estudio de Hot Spot, en el que se analizó la cavidad del sitio de unión de la proteína en función de las posibles interacciones que se pueden dar entre los residuos existentes y el ligando. La combinación de los resultados de Hot Spot con los de docking permitió reconocer los fragmentos de la molécula de mayor importancia para la inhibición de GSK-3. Por último, cabe destacar la importancia de los resultados obtenidos en los diferentes estudios, tanto in vitro como in sílico, que posibilitaron la descripción de un nuevo prototipo de inhibidores de XO y GSK-3. Esto permite generar novedosas modificaciones y optimizaciones estructurales para el diseño de inhibidores más potentes.