Caracterización celular y molecular de la sialiltransferasa ST3GAL-II : rol del disialogangliosido GD1a en la unión y endocitosis de anticuerpos asociados a Neuropatologías experimentales

Abstract

Los gangliósidos, una gran familia de glicoesfingolípidos ácidos, se componen de un segmento hidrofóbico, la ceramida, y un oligosacárido mono o polisialilado de longitud y composición variable. En las células, los gangliósidos se encuentran principalmente en la hemicapa externa de la membrana plasmática a la cual se insertan a través del residuo ceramida exponiendo el oligosacárido hacia el medioambiente extracelular. Estos glicolípidos han sido implicados en numerosos procesos fisiológicos que incluyen, crecimiento, diferenciación, migración y apoptosis entre otros, a través de la modulación de la actividad de receptores de membrana y de interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular. Además de su rol fisiológico, los gangliósidos también han sido asociados a un amplio espectro de procesos patológicos siendo receptores de virus, toxinas, lectinas y anticuerpos. Durante el presente trabajo de tesis se abordó el estudio de la unión y comportamiento endocítico de diferentes anticuerpos anti-glicolípidos (AGAb), particularmente de inmunoglobulinas que reconocen a los gangliósidos GD1a y GM1 en varias líneas celulares en cultivo. En primera instancia se caracterizó la unión, endocitosis y destino intracelular de diferentes anticuerpos monoclonales de isotipo IgG que unen con alta afinidad al gangliósido GD1a en células epiteliales derivadas de ovario de hámster chino (CHO-K1) y en células derivadas de neuroblastoma murino (Neuro-2a). Luego de unirse a membrana plasmática, una fracción minoritaria de un anticuerpo anti-GD1a (Ab1-GD1a) fue rápidamente endocitada a 37°C en células epiteliales mediante un mecanismo independiente de dinamina-2 y dependiente de Arf-6 colocalizando en una región yuxtanuclear principalmente con marcadores de endosomas de reciclado. Mientras que la cantidad asociada a la fracción celular fue mínima (20-25%) una fracción mayoritaria del anticuerpo inicialmente unida a membrana plasmática, fue recuperada en el medio de cultivo. Este anticuerpo permaneció principalmente localizado en la superficie celular en experimentos de endocitosis a 16°C, contrastando con la eficiente endocitosis de la proteína transferrina y de otro complejo gangliósido-anticuerpo (GD3-R24) a esta temperatura. Esta evidencia experimental sugiere la presencia de mecanismos selectivos de internalización celular de complejos gangliósidos-anticuerpos. Para determinar si la unión a membrana, endocitosis y destino intracelular es una característica compartida por los anticuerpos anti-GD1a, se incluyó en el estudio otro anticuerpo monoclonal anti-GD1a de diferente isotipo (Ab2-GD1a). Los resultados obtenidos muestran una mínima endocitosis de este anticuerpo en células epiteliales que involucra un mecanismo dependiente de Arf-6, junto con una drástica y rápida reducción de los niveles totales de Ab2-GD1a y localización del anticuerpo endocitado en una región yuxtanuclear. Esto indica un comportamiento comparable de ambos anticuerpos que reconocen GD1a sugiriendo que comparten procesos similares de unión y endocitosis en células epiteliales. Ab2-GD1a se une eficientemente a la superficie de células derivadas de neuroblastoma y se registra un moderado descenso de los niveles totales del anticuerpo comparado con la drástica reducción observada en las células epiteliales. Esto sugiere que el procesamiento endocítico de los anticuerpos anti-GD1a analizados también depende del tipo celular. Los estudios de unión y endocitosis fueron también investigados para un anticuerpo monoclonal contra el gangliósido GM1 (Ab2-GM1). Este anticuerpo se unió eficientemente a la membrana plasmática de células CHO-K1 y una fracción mayoritaria (60-70%) fue rápidamente endocitada a 37°C y acumulada en un compartimiento yuxtanuclear contrastando con la mínima endocitosis descripta para los anticuerpos que reconocen GD1a. Además, los niveles de Ab2-GM1 permanecieron inalterados y principalmente asociados a la membrana plasmática cuando los experimentos de endocitosis se realizaron a 37°C en células Neuro-2a, contrastando con lo observado para los anticuerpos anti-GD1a en esta línea celular. Por lo tanto, se observó que bajo idénticas condiciones experimentales, el tiempo de residencia en membrana plasmática y la fracción endocitada de anticuerpos anti-GD1a y anti-GM1 fueron notoriamente diferentes. En su conjunto, los datos experimentales sugieren que el comportamiento endocítico y procesamiento celular de cada anticuerpo anti-gangliósido puede variar en función del tipo de anticuerpo y del tipo celular, lo cual representa un aspecto clave a considerar en el estudio de sus roles patogénicos en neuropatías así como también en su uso como herramientas terapéuticas. Los gangliósidos son sintetizados por un conjunto de enzimas glicosiltransferasas y sialiltransferasas residentes de retículo endoplásmico (RE) y del complejo de Golgi. Éstas enzimas, en muchos casos organizadas como complejos multienzimáticos, utilizan como sustrato de partida ceramida (Cer) e incorporan monosacáridos de forma secuencial de manera que el producto de una enzima es sustrato de la siguiente en la vía biosintética (Fig. I-1). Como parte de este trabajo de tesis se caracterizó por primera vez la expresión, localización subcelular y modificaciones postraduccionales de la sialiltransferasa humana ST3Gal-II. Ésta es la principal enzima responsable de la biosíntesis in vivo del gangliósido GD1a a partir de GM1, ambos gangliósidos blanco de los anticuerpos anti-glicolípidos estudiados en la segunda parte de esta tesis. II es una proteína transmembrana tipo-II con un corto segmento citoplasmático N-terminal, un fragmento transmembrana y un gran dominio C-terminal orientado hacia el lumen del complejo de Golgi que contiene el sitio catalítico. La secuencia primaria de aminoácidos revela dos sitios potenciales de N-glicosilación, asparagina 92 y asparagina 211 (Asn92 y Asn211). Mediante ensayos bioquímicos, farmacológicos, de microscopía confocal y mutagénesis sitio dirigida se caracterizó la expresión, localización subcelular, ocupación y relevancia de los sitios de N-glicosilación en la localización y actividad in vitro de la enzima. ST3Gal-II se localiza en el complejo de Golgi de células CHO-K1 con predominio en compartimientos proximales y se expresa en similar proporción de monómero y dímero sensible al tratamiento con agentes reductores. La enzima se encuentra N-glicosilada principalmente en Asn211 y el glicano no es del tipo complejo, sino que contiene una alta proporción de residuos de manosa. La presencia del N-glicano en dicha posición es necesaria para la salida de la enzima del RE y su transporte y localización en el complejo de Golgi. La carencia del N-glicano en posición 211 influencia de manera negativa la actividad sialiltransferasa in vitro utilizando como aceptor un gangliósido (GM1) o una glicoproteína (asialofetuina), mientras que la falta del mismo en la posición 92 no afecta la actividad hacia la glicoproteína e influencia de manera positiva la actividad hacia el gangliósido. Una versión quimérica conteniendo el dominio N-terminal (NtD) de ST3Gal-II (aminoácidos 1-51) fusionada a la proteína fluorescente mCherry (ST3Gal-II-1-51-mCherry) se expresa en células CHO-K1 y se localiza en el complejo de Golgi. Esto sugiere que el NtD es necesario para el transporte desde el RE y retención de ST3Gal-II en el complejo de Golgi. Además, indicaría que el dominio C-terminal de ST3Gal-II depende de la N-glicosilación para alcanzar un estado conformacional óptimo de plegamiento que le permita salir del RE para localizarse adecuadamente en el aparato de Golgi, probablemente como un requerimiento del control de calidad de plegamiento de proteínas en RE, pero no sería un requerimiento excluyente para la retención de la enzima en el complejo de Golgi. Asimismo, el residuo cisteína presente en el NtD de ST3Gal-II tendría un rol en la formación y estabilización de la forma dimérica.