Estudio fenotípico y funcional de linfocitos T CD8+ Cd39+ en el contexto de la respuesta inmune antitumoral

Abstract

Las células tumorales poseen diversos mecanismos para evadir la respuesta inmune antitumoral gatillada por células de la inmunidad innata, como las células asesinas naturales (NK, del ingés Natural Killers), y de la inmunidad adaptativa, como los linfocitos T CD8+ (LiTCD8+). Entre las estrategias de evasión se encuentra la generación de un microambiente tumoral (MAT) inmunosupresor propiciado por la expresión superficial de las enzimas inmunomoduladoras CD39 y CD73. Estas moléculas son capaces de hidrolizar el ATP extracelular, un metabolito altamente inflamatorio, generando adenosina, una molécula inmunosupresora. Aunque se ha descrito que en condiciones fisiológicas normales los LiTCD8+ no expresan CD39 algunos estudios han reportado la presencia de LiTCD8+CD39+ en pacientes con cáncer. Sin embargo, las características fenotípicas y funcionales de estas células y la significancia biológica de la expresión de CD39 en LiTCD8+ no fueron abordadas. En este contexto, postulamos la hipótesis de que la exposición prolongada de los LiTCD8+ a estímulos del MAT podría favorecer la expresión de las ectoenzimas CD39 y CD73 en los mismos. A su vez, dichas moléculas podrían modular y/o ser indicativas del estado de diferenciación y la funcionalidad de estas células. Utilizando distintos modelos experimentales murinos de cáncer observamos que en el MAT una elevada frecuencia de LiTCD8+ adquiere la expresión de CD39, mientras que CD73 fue expresado de forma variable dependiendo del modelo experimental utilizado. En los LiTCD8+CD39+ intratumorales se distinguieron dos subpoblaciones con distinto grado de expresión de la ectoenzima: CD39int y CD39high. Los LiTCD8+CD39high fueron detectados exclusivamente en tumores y su frecuencia se encontró asociada a la progresión y a la inmunogenicidad de los mismos, mientras que en bazos y ganglios linfáticos drenantes (GD) solo se encontró una pequeña población de LiTCD8+CD39int. El análisis funcional de los LiTCD8+ mostró que un alto porcentaje de LiTCD8+CD39high producían interferón γ (IFNγ) y expresaban granzima B. Sin embargo, estas células también mostraron una reducida capacidad para producir factor de necrosis tumoral α (TNFα) e IL-2, un bajo potencial proliferativo y deficiencias metabólicas, al compararlas con LiTCD8+CD39- y CD39int. Todas estas observaciones permitieron inferir que los LiTCD8+CD39high intratumorales podrían encontrarse en un estado de agotamiento. Esto fue confirmado mediante el análisis de la expresión de receptores inhibitorios (RI), el cual demostró que LiTCD8+CD39high exhibían altos niveles de expresión de PD-1, Tim-3, TIGIT, LAG-3 y 2B4. De forma similar, LiTCD8+ específicos para un antígeno tumoral poseían en su mayoría un fenotipo CD39high, junto con una menor funcionalidad y mayor expresión de RIs que LiTCD8+CD39int específicos. Todos estos resultados nos permitieron proponer a CD39 como un marcador de LiTCD8+ exhaustos en el contexto del cáncer. En concordancia con la expresión de CD39, los LiTCD8+CD39high mostraron una alta capacidad para hidrolizar ATP extracelular, indicando que podrían tener un rol relevante en la modulación de la señalización purinérgica en el MAT. LiTCD8+CD39high purificados fueron además capaces de modular la producción de IFNγ por parte de LiTCD8+ respondedores in vitro, aunque ensayos de bloqueo de CD39 demostraron que esta modulación era independiente de la ectoenzima, lo que evidencia la existencia de otros mecanismos regulatorios en estas células. En este trabajo de tesis nos propusimos correlacionar los hallazgos realizados en modelos experimentales con lo que ocurre en pacientes con cáncer. Así, observamos que los tumores y GDs de pacientes con cáncer de mama estaban infiltrados por una población de LiTCD8+CD39+CD73-. Llamativamente, se detectó una mayor frecuencia de LiTCD8+CD39+ en GDs invadidos por células tumorales respecto a ganglios que no tenían células metastásicas, mientras que en sangre periférica no se detectó presencia de estas células. A su vez, el análisis fenotípico y funcional de los LiTCD8+CD39+ infiltrantes de tumores y GDs metastásicos demostró que dicha población también poseía un fenotipo exhausto en pacientes. Finalmente, estudios realizados in vitro permitieron proponer a las citoquinas IL-6 e IL-27 como posibles señales involucradas en la inducción de CD39 en LiTCD8+ murinos y humanos en cáncer, abriendo la posibilidad de explorar a estas citoquinas como posibles dianas terapéuticas. Todos los resultados obtenidos ponen en relevancia la posibilidad de utilizar a CD39 como un marcador de la respuesta inmune de LiTCD8+ frente a tumores en pacientes y en el pronóstico frente a distintos tratamientos. Los resultados de este trabajo nos permiten también postular que el bloqueo de CD39 podría tener efectos profundos en el MAT, afectando la funcionalidad de LiTCD8+ y otras poblaciones celulares. Además, este estudio descubre posibles funciones previamente ignoradas de los LiTCD8+ exhaustos que, lejos de ser células inertes, podrían tener un efecto relevante en el desarrollo del cáncer.