Control transcripcional del fenotipo : interacción entre factores bHLH y CREB

Abstract

La glándula pineal (GP) forma parte del sistema circadiano y, a través de la síntesis y liberación de melatonina nocturna, modula la fisiología y el comportamiento de los organismos. Por años se ha considerado que la GP es un órgano homogéneo en término de las células que la componen, las moléculas que se expresan y las funciones que cumple. Estudios recientes a nivel transcriptómico y proteómico han contribuido a desterrar ese paradigma. En el presente trabajo de tesis doctoral se postuló la hipótesis de que los factores de transcripción (FTs) NeuroD1 y CREB actuarían cooperativamente regulando el transcriptoma de la glándula pineal. Esta tesis incluyó múltiples estrategias para el análisis de la expresión génica: transcripción reversa seguida de la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), Real Time PCR e hibridación in situ radiactiva (HIS), y proteica: Western blot (WB) e inmunohistoquímica (IHQ) seguida de microscopía confocal y análisis morfométrico; de interacción entre proteínas: coimmunoprecipitación (CoIP), y de éstas con secuencias génicas especificas: ensayo de la luciferasa en la GP de rata y órganos controles. Con el uso de IHQ, observamos que CREB se encuentra en los núcleos de todos los linajes celulares que conforman la GP, siendo su distribución espacial diferente entre pinealocitos y células intersticiales. En los pinealocitos, se observaron diferencias en la disposición espacial de CREB, entre ellos, en un mismo ZT (Zeitgeber time) y a lo largo del ciclo L:O, presentando una mayor dispersión durante la fase de oscuridad. Además, el desafío quirúrgico de la extirpación de los ganglios cervicales superiores (GCSx) que inervan a la GP reveló un aumento en la distribución espacial del FT en pinealocitos durante la noche temprana (ZT14), con respecto a lo que ocurrió en animales controles y falsamente operados (FO). El uso de la ARN polimerasa II fosforilada (pPOLII) nos permitió concluir que la GP se encuentra transcripcionalmente activa durante el día y la noche. El análisis de la abundancia de CREB no mostró variaciones diarias en la GP: la proteína total se pudo identificar sin diferencia entre los ZTs analizados. En cuanto a NeuroD1, los niveles del transcripto y de la proteína no manifestaron variaciones diarias en la GP. En referencia a la interacción entre los FTs, la técnica de CoIP evidenció que NeuroD1 y CREB son capaces de coprecipitar durante la fase de luz (ZT6) en la GP y el cerebelo (Ce), órgano control. Ensayos de regulación de la transcripción mediada por CREB y NeuroD1 en una línea celular no pinealocítica señalaron que NeuroD1 modularía positivamente al promotor del gen Aanat, y que la combinación NeuroD1+E47 promovería la expresión de dicho gen en condición basal y bajo el efecto de norepinefrina (NE). En el caso de CREB, solo o en las combinaciones NeuroD1+CREB y NeuroD1+CREB+E47, exhibió un efecto modulador negativo sobre el promotor del gen Aanat, y el tratamiento con NE no produjo la activación de dicho promotor como ocurriría in vivo en la GP. El ensayo de la luciferasa demostró también que el FT NeuroD1 y la combinación NeuroD1+E47+Pdx1 modulan positivamente al promotor del gen de Ins (cinco copias del potenciador E2/A3) en una línea celular 6 no pancreática. En la GP de rata se examinó además, la expresión de potenciales genes blanco para NeuroD1, incluidos los de la vía de síntesis de melatonina e insulina. La expresión del gen Aanat se evidenció únicamente durante la noche (ZT18), mientras que las enzimas Tph1 e HIOMT mostraron diferencias sutiles en su expresión durante las fases de luz (ZT6) y de oscuridad (ZT18). Por otro lado, transcriptos de los componentes de la vía de señalización de insulina: Ins1, Cpe e Insr se hallaron expresados durante el día y la noche, sin variaciones diarias. Por HIS, se identificó el transcripto del Insr en GP, cerebelo e hipocampo, sin diferencias diarias. Por Real Time PCR, un método de mayor sensibilidad, se corroboró la presencia del gen de Ins1 en GP, Ce y células Min 6 productoras de Ins a ZT6. La GP presentó niveles mayores del transcripto en comparación con cerebelo. Además de caracterizar a NeuroD1 en la GP, se utilizó el páncreas para realizar un análisis comparativo de la presencia de ésta y otras moléculas importantes en su homeostasis y en la de la GP. Se halló que las proteínas NeuroD1, Pax6 e Ins se encuentran en los islotes pancreáticos de Langerhans, específicamente en las células β, a ZT6. Seguido, se investigó la proteína Ins en la GP mediante IHQ, y no se logró su identificación. De los resultados documentados aquí, podemos concluir que la GP es un órgano con elevada heterogeneidad y complejidad, y que CREB y NeuroD1 modularían la expresión de genes involucrados en la producción de melatonina, incluido Aanat, y otros relacionados con el mantenimiento y homeostasis del fenotipo pineal, como Ins. Es nuestro deseo que estos aportes contribuyan a un mejor entendimiento de los mecanismos celulares y moleculares que tienen lugar dentro de la GP, aún cuando sean mediados por moléculas comunes entre el sistema nervioso central (SNC) y otros órganos endócrinos. Además, esperamos que el conocimiento generado en este trabajo sea trasladable al campo de la medicina, y útil en el desarrollo de nuevas metodologías para diagnosticar, prevenir y tratar enfermedades. Entre ellas, podemos mencionar trastornos relacionados con desórdenes circadianos y metabólicos, como la diabetes, y enfermedades neurodegenerativas.