Rol del transporte de citoquinas mediado por proteínas de la familia Azg en la señalización hormonal durante el desarrollo del sistema radical de plantas (2014-2019)

Abstract

Las plantas han podido conquistar la tierra gracias a su plasticidad fenotípica. Parte de esta capacidad se explica por la posibilidad de generar nuevas estructuras a lo largo de la vida. En el presente trabajo se abordo la importancia de dos genes de la familia AZG (AtAzg1 y AtAzg2 ) en el desarrollo radical. Los antecedentes mostraban que estos genes codifica para potenciales transportadores de purinas y de algunos de sus derivados como las citoquininas. Ademas, experimentos realizados en Arabidopsis thaliana, señalaron que podrian estar relacionados con la regulacion de la arquitectura radical en estrecha relacion con los sistemas hormonales de plantas. Partiendo de esta base, nos propusimos en primer lugar comprender el origen de la familia genica especialmente en relacion con los sistemas de señalizacion hormonal. Mediante la busqueda de secuencias relacionadas en el grupo de Viridiplantae, se pudo obtener el primer arbol logenetico con los potenciales homologos de los genes de A. thaliana. La posibilidad de contar con un arbol permitido avanzar sustancialmente en el conocimiento acerca de la evolucion de esta familia genica. Se pudo relacionar la diversi cacion de la familia con eventos especificos como la conquista de la tierra y la aparicion de la raiz, asi como tambien se observo que los origenes de algunos sistemas de señalizacion coinciden con los de la familia genica AZG. Por otro lado, contar con gran numero de genes homologos de la familia, nos permite poner en relevancia secuencias altamente conservadas, asi como señalar regiones que expliquen las diferencias entre las variantes de los distintos genes de la familia AZGs. En el presente trabajo se continuo con la caracterizacion de los miembros de AZG de A. thaliana, AtAZG1 y AtAZG2, al estudiar la capacidad de ambos transportadores de interactuar con otras proteinas en el sistema de expresion heterologo de levaduras. Para ello, se realizaron ensayos de interaccion usando la tecnica de Split Ubiquitin System. En primer lugar, se pudo establecer que los transportadores son capaces de interactuar tanto consigo mismos como con el otro miembro de la familia. Es decir, se observaron asociaciones del tipo AZG1-AZG1, AZG2-AZG2 y AZG1-AZG2. Por otro lado, result o de inter es conocer la capacidad de estos transportadores de interactuar con algunos miembros de la cascada de senalizacion por citoquininas, por lo que se seleccionaron como candidatos los receptores y las fosfotransferasas. Si bien la interaccion de estas proteinas con AZGs habria resultado un interesante mecanismo de respuesta rapida para la regulacion del transporte de la hormona, no se observo interaccion entre AZGs con receptores de citoquininas y la interaccion con las fosfotransferasas no fue concluyente. A continuacion, se estudio el rol de estos transportadores en plantas. En primer lugar, se avanzo en la caracterizacion de la expresion de AZG1. Se pudo determinar que este gen se expresa en diversos organos y tejidos y que es inducible por exposicion a citoquininas. El estudio de distintas lineas mutantes del gen AtAzg1, mostraron que no existen diferencias evidentes en sus fenotipos al crecer en condiciones estandar. Sin embargo, motivados por observaciones hechas durante la descripcion de la expresion, se estudio la importancia del gen en la dominancia apical radical. Gracias a esto, se determino que AZG1 es importante para regular la regeneracion del sistema radical tras la escision del meristema apical radial. Para continuar el estudio de la relacion de este gen con citoquininas, se estudio como se desarrollan los mutantes del gen en presencia de la hormona. Se pudo determinar que la arquitectura radical era distinta en lineas carentes del gen, asi como en lineas que lo sobreexpresan, especialmente en el largo de la raiz principal. Para asegurar que esta diferencia se debe a la actividad de transportador se complementaron lineas deficientes en el transportador (knock-out), las cuales recobraron el fenotipo salvaje. Por otro lado se continuo con la caracterizacion de AZG2 en plantas. Si bien existian estudios previos sobre la expresion del gen, en el presente trabajo se pudieron profundizar y determinar que su expresion esta limitada solamente en un pequeño grupo de celulas rodeando los primordios de raiz lateral, correspondientes a la corteza y la epidermis. Ademas, se determino que existe otro dominio de expresion del gen en semillas en proceso de germinacion . Retomando su relacion con hormonas, se observo que en lineas knock-out mediante el reportero de citoquininas ARR5pro:GUS existan diferencias en la señalizacion, especialmente tras la aplicacion de la hormona. Esta diferencia en la señalizacion pudo ser cuantificada mediante el reportero de citoquininas TCSnpro:GFP. Este reportero mostro que lineas que no tienen AZG2 presentan menor actividad de citoquininas, relacionando asi los fenotipos descritos previamente para estas lineas al deficit en la señalizacion. Finalmente, se abordo el estudio de la localizacion subcelular de los transportadores mediante el uso de proteinas AZG fusionadas a proteinas uorescentes. AZG1 present o una clara localizacion en la membrana plasmatica en las distintas fusiones con proteinas uorescentes evaluadas. Por otro lado, la fusion con AZG2 fue localizada en la membrana plasmatica, aunque tambien se observo señal en el citosol. Mediante el uso de distintas construcciones y observando distintos tejidos, se pudo estimar que se tratara de reticulo endoplasm atico. Los resultados obtenidos en el presente trabajo permiten profundizar el conocimiento sobre el vinculo entre estos transportadores y la señalizacion hormonal en plantas. Se lograron establecer modelos que nos permiten explicar la actividad de ambos transportadores, contemplando su posicion en el contexto de señalizacion, su dominio de expresion asi como su localizacion y su relacion con otras vias de señalizaci on. Como perspectivas, el estudio permitio abrir nuevas puertas a proyectos de investigacion en curso que apuntan hacia el mejor entendimiento de la regulacion de la arquitectura radical.