Modulación de la actividad enzimática de la acetilcolinesterasa eritrocitaria bovina inducida por cambios en su ambiente molecular. Contribución al desarrollo de un biosensor para la detección de anaplasmosis bovina.

Abstract

La Acetilcolinesterasa Eritrocitaria Bovina (AEB) es una enzima con anclaje tipo GPI que hidroliza acetilcolina sérica. El subsitio “aniónico” ubicado en el sitio activo determina su especificidad, orientando la colina del sustrato a través de interacciones electrostáticas. Dado que cambios en el entorno molecular de las enzimas con anclaje GPI afectan sus parámetros cinéticos y que los monoterpenos (MT) afectan el orden y la electrostática de las membranas, en el presente trabajo evaluamos el efecto de 1-8 cineol, CIN y alcanfor, ALC sobre la hidrólisis de acetiltiocolina (ATC, método de Ellman) catalizada por AEB presente en Membrana Eritrocitaria Bovina (MEB). Además, presentamos y evaluamos el uso de AEB como sensor para ser usado en diagnósticos, tales como el de la enfermedad bovina Anaplasmosis. La afinidad del complejo AEB-MEB en ausencia de MTs (Km=0,1) fue significativamente afectado por CIN el cual resultó ser un potente inhibidor (Km=0,96) en comparación con ALC (Km=0,11) (Ambos a 0,3mM). Por otro lado, CIN exhibió una IC50=0,246mM mientras que la IC50 d el ALC fue mucho mayor a 0,8 mM. Las mediciones de anisotropía de fluorescencia (A) de DPH y TMA-DPH en MEB, demostraron que CIN afecta la organización tanto de la región interna como la de los grupos polares de la bicapa (redujo aproximadamente un 1% de ADPH y ATMA-DPH a 0,3 mM) mientras que ALC apenas afectó. El efecto de los MTs sobre las isotermas de compresión presión lateral () y potencial de superficie (ΔV) vs Área sobre filmes de Langmuir también se estudió. En presencia de CIN, la transición encontrada en la isoterma -A control se volvió menos cooperativa y el colapso disminuyó. A bajas , las pendientes de ambas isotermas (-A y ΔV-A) cambiaron, por ej. encontramos un ΔΔV~10mV con respecto al control sin CIN.A altas , la convergencia de las isotermas control y con CIN sugieren la expulsión de las moléculas del terpeno del film durante la compresión. ALC no produjo un gran efecto sobre ΔV, pero expandió ligeramente toda la isoterma -A hasta el punto de colapso. El efecto de la actividad enzimática de AEB debido a la adición de fosfolípidos cargados también se estudió, considerando esto como un mecanismo indudable para disminuir la diferencia de potencial de superficie, resultando en una potente inhibición de la AEB. Concluyendo, la actividad inhibitoria de CIN sobre la AEB puede estar relacionada a su accionar sobre el orden y electrostática de la membrana, lo cual puede interferir inespecíficamente con la interacción ATC-AEB en el sitio activo. El alcanfor mostró menos interacción con la membrana, pero su mecanismo inhibitorio está fuertemente influenciado por los cambios en su entorno y por ende en la conformación de la enzima. A través del análisis del biosensor obtenido, vimos que cambios del entorno molecular de AEB producidos por la transferencia al soporte sólido, lo cual produjo cambios de empaquetamiento, inmovilización de la enzima y cambios en el dipolo general de la monocapa, disminuyeron la Vmáx sin afectar la afinidad por el sustrato.